여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.
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방법 논문
인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
위성 세포 (SC)는 근섬유의 원형질 막과 주변 기저 층 사이에 위치한 근육 줄기 세포입니다. 그들은 근육 재생에 필수적입니다. 골격근에서 자주 발생하는 부상시 SC가 활성화됩니다. 그들은 근육 아세포로 증식하고 근육 병변을 치료하기 위해 분화합니다. 근육 분화 동안 일어나는 많은 사건 중에서, 세포질 Ca 2+ 신호는 매우 중요합니다. Ca 2+ 신호는 Ca 2+ 가 내부 Ca 2+ 저장소에서 방출 될뿐만 아니라 세포 외부 공간에서 칼슘 2+ 가 들어간 것, 특히 상점 운영 Ca 2+ 입구 (SOCE)에서 발생합니다. 이 논문은 정형 외과 수술 후 수집 된 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수한 집단을 얻기 위해 사용 된 방법을 설명합니다. 조직은 기계적 및 효소 적으로 소화되며, 세포는 증폭되어 speci의 존재에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분류된다fic 막 마커. 일단 얻은 인간의 myoblasts 확장 및 배양 매체에서 성장 인자를 제거하여 차별화에 전념. 특정 전사 인자 및 시험 관내 면역 형광의 발현 수준은 대조 조건 및 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 정지시킨 후에 근원적 인 분화 과정을 평가하는데 사용된다. 마지막으로, Fura-2의 비율을 SOC의 신뢰성 있고 재현성있는 측정을 제공하는 비율 계 Ca 2+ 프로브로 사용합니다.
서론
인간 골격근은 근원 전구 세포의 융합으로 인한 수축성 다핵 근육 섬유 군으로 구성됩니다. 골격 근육은 근섬유 (원형질막)의 원형질 막과 기저 층 (basal lamina) 사이에 위치한 골격근 줄기 세포 인 SC의 존재로 인해 손상 후 재생성 할 수 있습니다. 손상되지 않은 근육에서 SC는 주로 정지 상태에 있습니다. 기계적 스트레스 나 부상에 반응하여 SC는 활성화되고 (myoblast), 증식하고, SC pool 1 , 2 를 보충하기 위해 새로운 myofibers를 형성하기 위해 분화되거나 자체 갱신됩니다. 수년에 걸쳐 골격근 생검에서 SC 및 그 자손 인 myoblast를 분리하기위한 몇 가지 기술이 개발되었습니다. 이 세포들에 표현 된 세포 표면 마커들과 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS) 3 의 방법론에 대한 더 깊은 이해로, 4 , 5 , 이제 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수 집단을 분리하는 것이 가능합니다.
칼슘 시그널링은 골격근 발달, 항상성 및 ....
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프로토콜
건강한 환자의 정형 외과 수술 중에 수술 용 폐기물로 인간 근육 샘플 (반결질 근육에서 얻은 조직)을 채취했습니다. 인체 연구와 관련된 모든 방법은 스위스 규정 보건 당국의 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 스위스 제네바 당국 (Commission Cantonale d' Ethique de la Recherche)의 승인을 받았다 (프로토콜 CER 번호 12-259) . 이 연구에 참여한 모든 성인 피험자로부터 정보 및 서면 동의를 얻었습니다.
1. 인간 골격근으로부터 근섬유의 분리
- 모든 절차 동안, 수준 II 조직 배양 후드에서 작업하고 멸균 배지 및 멸균 완충액을 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오.
참고 :이 절차는 많은 인간 골격 근육에 적용 할 수 있습니다.
2. 해리 프로토콜
- 근육 샘플 (2 - 3g)을 무균 6cm플레이트.
- 인산 완충 식염수 (PBS) 5 - 10 ML로 근육 샘플을 씻으십시오. 세척을 반복하십시오.
- 굽은 가위와 클램프를 사용하여 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다.
- 근육 샘플을 계량하고 (2.13 단계 참조) 새로운 무균 6cm 플레이트로....
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결과
인간 근육 샘플의 효소 해리 후, 세포는 GM에서 증폭되었다. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- 세포로 정의 된 사람의 myoblasts는 FACS 후에 얻어졌다. Myoblast는 분석 된 인구의 60 % 이상을 차지했습니다 ( 그림 1 ). 일차 인간의 myoblasts는 재결합, 합류로 성장하고, DM에서 48 시간 동안 배양했다. 전사 인자 MEF2와 근육 특이 적 단백질 myosin heavy chain (MyHC)의 발현에 대한 면역 염색 후 융합 지수가 60.9 ± 1.3 % 인 세포가 대다수의 세포 에서 Myotubes in MyHC 양성 세포 (MyHC 양성 세포) (n = 5, 그림 2 ). 우리는 예비 세포라고 불리는 인간 근섬유의 약 40 %가이 말단 분화를 피하고 미분 화 단핵구 세포로 남아 있음을 관찰했다. 기능적 연구를 위.......
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토론
성체 골격근으로부터의 인간 myoblasts의 분리 및 배양은 근육 분화 및 근육 재생을 연구하는 in vitro 모델을 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 간단하고 비용 - 제한된 방식으로 인간 myoblasts의 높은 수율의 정화를 허용 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 기술은 고립 된 myoblasts의 비율과 myogenic 차별화의 효율성 측면에서 신뢰성과 재현성 결과를 제공합니다. 사실, 우리는 세포 정렬 후 인간 myoblasts의 약 60 %를 얻었다. 이 세포는 최대 6 계통 (약 30 배)의 배양 조건에서 유지되고 차별화 된 능력을 유지할 수 있습니다. 또한 DM에서 2 ~ 3 일 후에 myoblast 융합이 최대가되어 GM에서 DM으로 배지를 바꾸면 근원적 인 분화가 빠르게 일어난다. 이 모델에서 DM의 2 일 후에 myoblasts의 약 60 %가 myotubes 안으로 융합됩니다. 또 다른 이점은 이들 1 차 사람 세포l 배양은 si.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (부여 번호 310030-166313), "Fondation Suisse la recherche sur les les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant"및 "Fondation pour la recherche ostéo articulaire"에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 햄' s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| 인슐린 | 시그마 | I9278 | |
| 크레아틴 | 시그마 | 27900 | |
| 피루브산 | 시그마 | P4562 | |
| 우리딘 | 시그마 | U3003 | |
| 겐타마이신 | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| 트립신-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μ m 세포 여과기 | Falcon | 352350 | |
| 40 μ m 세포 여과기 | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL 튜브 | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL 튜브 | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| 마운팅 배지 | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | 농축액 |
| 마우스 안티 마이오게닌 | BD Pharmigen | 556358 | |
| 토끼 안티 MEF2 | 산타 크루즈 생명공학 | C-21 | |
| 염소 안티 마우스 Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| 염소 안티 토끼 Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| 마우스 안티 휴먼 CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| 마우스 안티 휴먼 CD146-PECy7 | BD Pharmingen 562135 | ||
| 마우스 안티 휴먼 CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen 562279 | ||
| 마우스 안티 휴먼 CD34-APC | BD Pharmingen 345804 | ||
| 마우스 안티 휴먼 CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 마우스 IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 마우스 IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 마우스 IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC 마우스 IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE 마우스 IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 주의: 독성 화합물 |
| 파라포름알데히드 | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | 주의 : 독성 화합물 |
| 비율 이미징 수집 소프트웨어: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20은 Fischman, D.A.에 의해 DSHB에 기탁되었습니다. |
참고문헌
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C.,
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재인쇄 및 허가
