Summary

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Published: May 28, 2017
doi:

Summary

Descrevemos aqui um protocolo para o mapeamento gen�ico dos s�ios de integra�o de vectores retrovirais baseados em v�us de leucemia murina de Moloney em c�ulas humanas.

Abstract

Os vectores retrovirais baseados em vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) integram-se predominantemente em intensificadores e promotores acetilados. Por esta razão, os locais de integração mLV podem ser utilizados como marcadores funcionais de elementos reguladores activos. Aqui, apresentamos uma ferramenta de varredura retroviral, que permite a identificação genoma-wide de potenciadores e promotores específicos de células. Resumidamente, a população de células alvo é transduzida com um vector derivado de mLV e o ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição de corte frequente. Após ligação dos fragmentos genómicos com um ligador de ADN compatível, a reacção em cadeia da polimerase mediada por ligante (LM-PCR) permite a amplificação das junções do genoma do vírus-hospedeiro. A sequenciação maciça dos amplicões é utilizada para definir o perfil de integração de mLV em todo o genoma. Finalmente, agrupamentos de integrações recorrentes são definidos para identificar as regiões reguladoras específicas de células, responsáveis ​​pela ativação de programas de transcrição específicos de células.

<p class= "Jove_content"> A ferramenta de varredura retroviral permite a identificação genômica de promotores e intensificadores específicos de células em populações de células alvo prospectivamente isoladas. Notavelmente, a varredura retroviral representa uma técnica instrumental para a identificação retrospectiva de populações raras ( por exemplo , células estaminais somáticas) que não possuem marcadores robustos para isolamento prospectivo.

Introduction

A identidade celular é determinada pela expressão de conjuntos específicos de genes. O papel dos elementos reguladores cis, tais como promotores e intensificadores, é crucial para a activação de programas de transcrição específicos do tipo celular. Estas regiões reguladoras são caracterizadas por características específicas da cromatina, tais como modificações peculiares das histonas, factores de transcrição e ligação dos co-factores e acessibilidade à cromatina, que têm sido amplamente utilizados para a sua identificação genómica em vários tipos de células 1 , 2 , 3 . Em particular, o perfil gen�ico de acetila�o da histona H3 lisina 27 (H3K27ac) � comummente utilizado para definir promotores activos, potenciadores e super-potenciadores 4 , 5 , 6 .

O vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) é um gamma-retrovírus que é amplamente utilizado para o geneTransferência em células de mamíferos. Depois de infectar uma célula alvo, o genoma retroviral de ARN é retrotraducido numa molécula de ADN de cadeia dupla que se liga a proteínas virais e celulares para montar o complexo de pré-integração (PIC). O PIC entra no núcleo e liga a cromatina da célula hospedeira. Aqui, a integrase viral, um componente PIC chave, medeia a integração do ADN proviral no genoma da célula hospedeira. A integração de mLV no DNA genómico não é aleatória, mas ocorre em elementos reguladores cis-activos, tais como promotores e intensificadores, numa forma específica de célula 7 , 8 , 9 , 10 . Este perfil de integração peculiar é mediado por uma interacção directa entre a integrase de mLV e as proteínas do domínio do bromodominio celular e do domínio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . As proteínas BET (BRD2, BRD3 eBRD4) atuam como uma ponte entre a cromatina do hospedeiro e o PIC mLV: através de seus bromodominios eles reconhecem regiões reguladoras cis altamente acetiladas, enquanto que o domínio extraterminal interage com a integrase mLV 11 , 12 , 13 .

Aqui, descrevemos a varredura retroviral, uma nova ferramenta para mapear regiões cis-reguladoras ativas com base nas propriedades de integração de mLV. Resumidamente, as células são transduzidas com o vector retroviral derivado de mLV que expressa o gene repórter de proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Após a extracção do ADN genómico, as junções entre a repetição terminal longa (LTR) 3 'do vector mlV e o ADN genómico são amplificadas por PCR (LM-PCR) mediada por ligantes e sequenciadas maciçamente. Os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano e as regiões genómicas altamente direccionadas por mLV são definidas como agrupamentos de locais de integração de mLV.

Varredura retroviralNing foi usado para definir elementos específicos reguladores de células específicas em várias células primárias humanas 14,15. MLV co-mapeados com promotores epigenicamente definidos e potenciadores, a maioria dos quais abrigou marcas de histonas activas, tais como H3K27ac, e foram específicos de células. A varredura retroviral permite a identificação genômica de elementos reguladores do DNA em populações de células purificadas prospectivamente 7,14 , bem como em populações celulares retrospectivamente definidas, como as células-tronco de queratinócitos, que carecem de marcadores efetivos para o isolamento prospectivo 15 .

Protocol

1. Transdução MLV de Células Humanas Isolar as c�ulas alvo e transduzi-las com um vector retroviral derivado de mLV contendo o gene rep�ter eGFP e pseudotipado com o VSV-G de estomatite vesicular ou a glicoprote�a de envelope anfotr�ico 16 . Manter as células simuladas transduzidas como um controlo negativo para as seguintes análises. Uma vez que os vectores retrovirais baseados em mLV podem transduzir células de divisão eficiente, c…

Representative Results

Fluxo de trabalho do procedimento de varredura retroviral O fluxo de trabalho do procedimento de varrimento retroviral é esquematizado na Figura 1 . A população de células alvo é purificada e transduzida com um vector retroviral derivado de mLV que expressa um gene repórter eGFP. O transgene é flanqueado pelas duas repetições terminais longas idênticas (5 'e 3' LTR), assegurando a s…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para genoma de todo o mapeamento dos locais de integração de mLV, um retrovírus que metas regiões cromatina, epigenicamente marcado como promotores ativos e potenciadores. As etapas críticas e / ou limitações do protocolo incluem: (i) a transdução mLV da população de células alvo; (Ii) amplificação de junções vírus-hospedeiro por LM-PCR; (Iii) recuperação de uma fração elevada de locais de integração. Os vectores retrovirais baseados em mLV transduzem eficientemente …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho Europeu de Investigação (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), do Ministério italiano da Educação, Universidades e Investigação (FIRB-Futuro em Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro em Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), o Ministério Italiano da Saúde (Jovens Pesquisadores Chamam 2011 GR-2011-02352026) ea Imagine Institute Foundation (Paris, França).

Materials

PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6X Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

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Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

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