Peptid og Protein kvantificering ved hjælp af automatiseret Immuno-MALDI (iMALDI)
Summary
En protokol til protein kvantificering i komplekse biologiske væsker ved hjælp af automatiserede immuno-MALDI (iMALDI) teknologi præsenteres.
Abstract
Massespektrometri (MS) er en af de mest almindeligt anvendte teknologier til kvantificering af proteiner i komplekse prøver, med fremragende assay specificitet som følge af direkte påvisning af masse-til-lade forholdet mellem hvert mål molekyle. Men MS-baseret proteomics, ligesom de fleste andre analytiske teknikker, har en bias i retning af måling af høj-overflod analysander, så det er en udfordring for at opnå registrering begrænser lav ng/ml eller pg/mL i komplekse prøver, og dette er koncentrationsområde for mange sygdom-relevante proteiner i biofluids såsom humant plasma. For at hjælpe med påvisning af lav-overflod analysander, er immuno-berigelse blevet integreret i analysen at koncentrere sig og rense analysand før MS måling, væsentligt forbedre assay følsomhed. I dette arbejde, er immuno – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation (iMALDI) teknologien præsenteret for kvantificering af proteiner og peptider i biofluids, baseret på immuno-berigelse på perler, efterfulgt af MALDI-MS måling uden forudgående eluering. Anti-peptid antistoffer er functionalized på magnetiske perler, og inkuberes med prøver. Efter vask, perlerne overføres direkte på en MALDI target tallerken, og signalerne, der er målt ved en MALDI-tid for flyvning (MALDI-TOF) instrument efter matrix løsningen er blevet anvendt til perlerne. Forberedelse eksempelprocedure er forenklet i forhold til andre immuno-MS assays og MALDI måling er hurtig. Den hele prøveforberedelse er automatiseret med flydende håndtering system, med forbedret assay reproducerbarhed og højere overførselshastighed. I denne artikel, iMALDI analysen bruges til bestemmelse af peptid angiotensin jeg (Ang jeg) koncentration i plasma, der anvendes klinisk som udlæsning af plasma renin aktivitet for screening af primær aldosteronism (PA).
Introduction
Massespektrometri blevet et uundværligt værktøj i kvantitative proteomics. Massespektrometri kan bestemme masserne af target proteiner eller peptider, derfor opnåede analysand signaler kan være meget specifik i forhold til immunassays. To metoder, ioniserende stråling, electrospray og MALDI, er mest almindeligt anvendt til påvisning af proteiner og peptider1,2,3,4. En stor udfordring i MS-baseret protein kvantificering ligger i påvisning af lav-overflod proteiner i komplekse prøver på ng/mL eller pg/mL koncentrationer i overværelse af høj-overflod proteiner, og mange kandidat protein biomarkører fundet i humant plasma er inden for dette område5. Dette problem skyldes i vid udstrækning i sagens natur bredt dynamikområde og kompleksitet af den menneskelige proteom6.
For at overvinde udfordringerne påvisning, immuno-MS metoder er blevet udviklet for at berige target proteiner eller peptider fra prøven løsninger på en solid overflade, efterfulgt af eluering af analysander og MS måling7,8 , 9 , 10. gennem immuno-berigelse, analysander er renset fra komplekse prøver og derfor ion-undertrykkelse virkninger fra andre molekyler er minimeret. Blandt forskellige solid understøtter, er magnetiske perler i øjeblikket mest udbredt som de ikke har fordelene af høj antistof bindende kapacitet og nem håndtering. Magnetiske perler med forskellige functionalizations og størrelser er blevet udviklet og kommercialiseret for immunoprecipitation eksperimenter. Til dato, har immuno-berigelse på perler været forbundet med både electrospray Ionisation (ESI) og MALDI-MS til protein og peptid måling. Stabil isotop standarder og erobring af anti-peptid antistoffer (SISCAPA) teknologi, er proteiner i prøverne fordøjet, efterfulgt af inkubation med antistof-perler for immuno-berigelse. I “klassisk” SISCAPA erobrede proteotypic peptider elueres fra glasperler og målt af Liquid Chromatography-ESI-MS (LC-MS), eller ved direkte infusion ESI-flere reaktion monitorerings-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Immuno-berigelse forbedret MRM assay følsomhed ved 3-4 ordrer størrelsesorden, at nå frem til lave ng/mL række13.
I forhold til electrospray-MS, MALDI-MS er hurtigere, og involverer ikke rengøring og re ækvilibrering LC kolonner så der er ingen fremførsel og forurening problemer, hvilket gør det mere velegnet til høj overførselshastighed studier14. Immuno-MALDI teknologi er blevet udviklet i vores laboratorium til at kombinere immuno-berigelse med MALDI-MS til følsom og specifik kvantificering af peptider og proteiner (baseret på kvantitering af proteotypic peptider)15,16 ,17. Perlerne er deponeret på en MALDI target plade efter immuno-berigelse, matrix løsningen føjes til perler, og pladen er klar til analyse af en MALDI-TOF-MS efter tørring. Eluering af peptider fra perlerne er ikke udføres som et separat trin, men affinitet-bundet analysander er elueret af MALDI matrix løsning, når det føjes til perle steder, derved forenkle forberedelsen af prøver og minimere prøve tab. IMALDI-teknologi har været anvendt i en række forskellige applikationer18,19, og for nylig har været automatiseret og bruges til at måle Angiotensin jeg (Ang jeg) til bestemmelse af plasma renin aktivitet (PRA)20. Denne protokol vil demonstrere den procedure, der anvendes til at udføre en automatiseret iMALDI assay. Tager PRA analysen som et eksempel, Inter dag CVs på mindre end 10% har opnået gennem automatisering, med mulighed for at måle 744 prøver pr. dag20.
IMALDI PRA analysen fremgår af håndskriftet ikke kræver protein fordøjelse, som target molekyle (Ang jeg) er et peptid med en molekylevægt på 1295.7 Da. I andre assays hvor protein fordøjelse er nødvendige og en peptid bruges som surrogat for intakt protein, skal den valgte peptid for iMALDI være unik og specifik for target proteinet, med en masse over 800 Da så at det nemt kan skelnes fra c hemical støj fra MALDI matrix løsning. Anti-peptid antistoffer er nødvendige for immuno-berigelsen af peptider. Protokol for en iMALDI analyse måling PRA består af fire trin: 1) generation af Ang jeg i humant plasma; 2) immuno-berigelse af Ang jeg bruger antistof-perler; 3) overførsel af perler til en MALDI target plade og tilføje matrix løsning; og 4) signal erhvervelse af en MALDI-TOF-MS og data analyse20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med konventionelle MS-baseret protein kvantificering, bruger iMALDI antistoffer til at berige analysander og rense dem fra komplekse prøver, derfor gør det muligt at kvantificere proteiner eller peptider ved lave koncentrationer. Et kritisk trin i iMALDI protokol er immuno-berigelse af target peptider. Til dette formål, skal være markeret antistoffer med høj specificitet og affinitet. I SISCAPA, er blevet rapporteret, at antistof tilhørsforhold på 10-9 M eller bedre ville være nødvendige …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker den finansielle støtte fra genom Canada og genom British Columbia for operationer (204PRO) og teknologiudvikling (214PRO) gennem genom innovationer netværk (GIN). Vi takker Drug Discovery Platform på forskningsinstitut for McGill University Health Center for brugen af MALDI-TOF instrument til at filme. H.L. er taknemmelig for støtte fra en postdoc stipendium fra det nationale Science and Engineering Research Rådet i Canada (NSERC). C.H.B er taknemmelig for støtte fra forkant Endowment Fund (LEEF). C.H.B. er taknemmelig for støtte fra Segal McGill stol i molekylær onkologi på McGill universitetet (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. og C.H.B. er taknemmelig for støtte fra Warren Y. Soper Charitable Trust og Alvin Segal Family Foundation til den jødiske General Hospital (Montreal, Quebec, Canada).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
