पेप्टाइड और प्रोटीन ठहराव का उपयोग स्वचालित bliss-मालदी (iMALDI)
Summary
स्वचालित bliss-मालदी (iMALDI) तकनीक का उपयोग करके जटिल जैविक द्रव्यों में प्रोटीन ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है.
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक जटिल नमूनों में प्रोटीन को बढ़ाता है के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकियों में से एक है, एक लक्ष्य अणु की जन के प्रत्यक्ष का पता लगाने का एक परिणाम के रूप में उत्कृष्ट परख विशिष्टता के साथ । हालांकि, एमएस-आधारित प्रोटियोमिक्, सबसे अंय विश्लेषणात्मक तकनीकों की तरह, उच्च बहुतायत analytes को मापने की दिशा में एक पूर्वाग्रह है, तो यह कम एनजी/एमएल या स्नातकोत्तर/एमएल के जटिल नमूनों में पता लगाने की सीमा को प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, और यह कई के लिए एकाग्रता रेंज है रोग-मानव प्लाज्मा जैसे तरल पदार्थ में प्रासंगिक प्रोटीन । कम बहुतायत analytes का पता लगाने में सहायता करने के लिए, bliss-संवर्धन परख में एकीकृत किया गया है ध्यान केंद्रित करने और एमएस माप से पहले analyte शुद्ध, काफी परख संवेदनशीलता में सुधार । इस कार्य में bliss-मैट्रिक्स की सहायता से लेसर Desorption/Ionization (iMALDI) तकनीक के ठहराव-मोतियों पर bliss-संवर्धन के आधार पर, पूर्व रेफरेंस के बिना मालदी-एमएस माप के अनुसार, में प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए प्रस्तुत है । विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी चुंबकीय मोतियों पर कार्यात्मक रहे हैं, और नमूनों के साथ मशीन । धोने के बाद, मोती सीधे एक मालदी लक्ष्य प्लेट पर स्थानांतरित कर रहे हैं, और संकेत मैट्रिक्स समाधान मोतियों के लिए लागू किया गया है के बाद एक मालदी उड़ान के समय (मालदी-तोफ) साधन द्वारा मापा जाता है । नमूना तैयारी प्रक्रिया अन्य bliss-एमएस परख की तुलना में सरलीकृत है, और मालदी माप तेजी से है. पूरे नमूना तैयारी एक तरल हैंडलिंग प्रणाली के साथ स्वचालित है, बेहतर परख reproducibility और उच्च प्रवाह के साथ । इस अनुच्छेद में, iMALDI परख पेप्टाइड एन्जियोटेन्सिन मैं (मैं) प्लाज्मा, जो नैदानिक प्राथमिक aldosteronism (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) की स्क्रीनिंग के लिए प्लाज्मा रेनिन गतिविधि के readout के रूप में इस्तेमाल किया जाता है में एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Introduction
मास स्पेक्ट्रोमेट्री मात्रात्मक प्रोटियोमिक् में एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्ष्य प्रोटीन या पेप्टाइड्स की जनता निर्धारित कर सकते हैं, इसलिए प्राप्त analyte संकेतों immunoassays की तुलना में अत्यधिक विशिष्ट किया जा सकता है । दो ionization विधियों, electrospray और मालदी, सबसे अधिक प्रोटीन और पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है1,2,3,4. एमएस-आधारित प्रोटीन ठहराव में एक प्रमुख चुनौती उच्च बहुतायत प्रोटीन की उपस्थिति में एनजी/एमएल या स्नातकोत्तर/एमएल सांद्रता में जटिल नमूनों में कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने में निहित है, और कई उंमीदवार प्रोटीन मानव प्लाज्मा में पाया मार्क्स है इस श्रेणी के भीतर5। यह समस्या मुख्यतः मानव proteome की अंतर्निहित व्यापक गतिशील रेंज और जटिलता के कारण होता है6।
इन का पता लगाने की चुनौतियों से उबरने के लिए, bliss-एमएस तरीकों लक्ष्य प्रोटीन या पेप्टाइड्स नमूना समाधान से एक ठोस सतह पर समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया है, analytes और एमएस माप के रेफरेंस के बाद7,8 , 9 , 10. bliss-संवर्धन के माध्यम से, analytes जटिल नमूनों से शुद्ध कर रहे हैं और इसलिए आयन-दमन प्रभाव अन्य अणुओं से कम कर रहे हैं. विभिन्न ठोस समर्थन के अलावा, चुंबकीय मोतियों वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से वे उच्च एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता और हैंडलिंग में आसानी का लाभ है के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । विभिंन functionalizations और आकारों के साथ चुंबकीय मोती विकसित किया गया है और immunoprecipitation प्रयोगों के लिए वाणिज्यिक । तिथि करने के लिए, bliss-संवर्धन मोतियों पर दोनों electrospray ionization (ईएसआई) और प्रोटीन और पेप्टाइड माप के लिए मालदी-एमएस के साथ इंटरफेस किया गया है । स्थिर आइसोटोप मानकों और कब्जा विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी (SISCAPA) प्रौद्योगिकी, नमूनों में प्रोटीन में पचा रहे हैं, bliss-संवर्धन के लिए एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के साथ मशीन द्वारा पीछा किया । “शास्त्रीय” SISCAPA में, कब्जा कर लिया proteotypic पेप्टाइड्स मोतियों से eluted हैं, और तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा मापा-ईएसआई-एमएस (LC-ms), या प्रत्यक्ष अर्क ईएसआई द्वारा-एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी-एमएस (ईएसआई-MRM-ms)11,12. bliss-संवर्धन परिमाण के 3-4 आदेश द्वारा MRM परख संवेदनशीलता में सुधार, कम एनजी पहुंच/
electrospray-ms की तुलना में, मालदी-ms तेजी से है, और नियंत्रण रेखा की सफाई और पुन: equilibration को शामिल नहीं करता है तो कोई स् और प्रदूषण के मुद्दे हैं, यह अधिक उच्च प्रवाह के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने14. bliss-मालदी प्रौद्योगिकी हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है bliss-संवर्धन के साथ गठबंधन करने के लिए मालदी-MS के संवेदनशील और विशिष्ट ठहराव के लिए पेप्टाइड्स और प्रोटीन (quantitation पेप्टाइड्स के proteotypic के आधार पर)15,16 ,17. bliss-संवर्धन के बाद, मोतियों को मालदी लक्ष्य प्लेट पर जमा किया जाता है, मैट्रिक्स समाधान को मोतियों से जोड़ा जाता है, और प्लेट को सूखने के बाद एक मालदी-तोफ-MS द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार रखा जाता है । मोतियों से पेप्टाइड्स का रेफरेंस एक अलग कदम के रूप में नहीं किया जाता है, लेकिन संबंध-बाउंड analytes को मनका धब्बों में जोड़ दिया जाए तो मालदी मैट्रिक्स सॉल्यूशन से eluted जाता है, जिससे नमूना तैयारी को सरल बनाता है और नमूना हानि को कम करता है. iMALDI प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म में लागू किया गया है18,19, और हाल ही में स्वचालित किया गया है और एन्जियोटेन्सिन मैं (मैं) प्लाज्मा रेनिन गतिविधि (प्रा.) का निर्धारण करने के लिए आंग को मापने के लिए इस्तेमाल किया20। इस प्रोटोकॉल के लिए एक स्वचालित iMALDI परख प्रदर्शन करते थे प्रक्रिया का प्रदर्शन करेंगे । एक उदाहरण के रूप में प्रा परख लेते हुए, 10% से कम के अंतर दिवस सीवी स्वचालन के माध्यम से प्राप्त किया गया है, प्रति दिन ७४४ नमूनों को मापने की क्षमता के साथ20।
iMALDI प्रा इस पांडुलिपि में प्रदर्शन किया परख प्रोटीन पाचन की आवश्यकता नहीं है, लक्ष्य अणु के रूप में (मैं आंग) १२९५.७ दा की एक आणविक वजन के साथ एक पेप्टाइड है । अंय परख में जहां प्रोटीन पाचन आवश्यक है और एक पेप्टाइड बरकरार प्रोटीन के लिए किराए के रूप में प्रयोग किया जाता है, iMALDI के लिए चयनित पेप्टाइड अद्वितीय और लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट होना चाहिए, एक बड़े पैमाने पर के साथ ८०० दा इतना है कि यह आसानी से ग से प्रतिष्ठित किया जा सकता है मालदी मैट्रिक्स समाधान से hemical शोर । पेप्टाइड्स के bliss-संवर्धन के लिए विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी की आवश्यकता है । एक iMALDI परख को मापने के लिए प्रोटोकॉल चार कदम: 1 मानव प्लाज्मा में आंग मैं की पीढ़ी के होते हैं; 2) bliss-मैं एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग आंग के संवर्धन; 3) एक मालदी लक्ष्य प्लेट को मोतियों का हस्तांतरण और मैट्रिक्स समाधान जोड़ने; और 4) एक मालदी द्वारा संकेत अधिग्रहण-तोफ-एमएस और डेटा विश्लेषण20।
Protocol
नीचे वर्णित रिएजेंटों की मात्रा 20 रोगी प्लाज्मा नमूनों की माप पर आधारित हैं । नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल विक्टोरिया & #39 के विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों का पालन; एस मानव अनुसंधान आचार समिति । < p class = "jov…
Representative Results
Discussion
पारंपरिक एमएस आधारित प्रोटीन ठहराव की तुलना में, iMALDI एंटीबॉडी का उपयोग करता है analytes को समृद्ध और जटिल नमूनों से उन्हें शुद्ध, इसलिए यह संभव कम सांद्रता पर प्रोटीन या पेप्टाइड यों को बढ़ाता है. iMALDI प्रोटोकॉ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जीनोम कनाडा और जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया से संचालन (204PRO) और प्रौद्योगिकी विकास (214PRO) के लिए जीनोम नवाचारों नेटवर्क (जिन) के माध्यम से वित्तीय सहायता का धंयवाद । हम मालदी के उपयोग के लिए मैकगिल विश्वविद्यालय स्वास्थ्य केंद्र के अनुसंधान संस्थान में दवा डिस्कवरी मंच-तोफ उपकरण फिल्माने के लिए धंयवाद । H.L. कनाडा के राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) से एक postdoctoral फैलोशिप से समर्थन के लिए आभारी है । सी. एच. बी. अग्रणी धार बंदोबस्ती कोष (LEEF) से समर्थन के लिए आभारी है । C.H.B. मैकगिल विश्वविद्यालय (मॉंट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) में आण्विक ऑन्कोलॉजी में सहगल मैकगिल कुर्सी से समर्थन के लिए आभारी है । M.X.C. और C.H.B. वॉरेन Y. ःपर चैरिटेबल ट्रस्ट और एल्विन सहगल परिवार फाउंडेशन से यहूदी जनरल अस्पताल (मॉंट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) के समर्थन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
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