Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)
Summary
Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.
Abstract
Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l’intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l’analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno – Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l’analisi di iMALDI è usata per determinare l’angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).
Introduction
Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in campioni complessi alle concentrazioni ng/mL o pg/mL in presenza di alta-abbondanza di proteine, e molti candidati proteine biomarcatori trovati nel plasma umano sono all’interno di questa gamma5. Questo problema è causato in gran parte dall’intrinsecamente ampio range dinamico e dalla complessità del proteoma umano6.
Per superare queste difficoltà di rilevazione, sono stati sviluppati metodi immuno-MS per arricchire il bersaglio proteine o peptidi da soluzioni campione su una superficie solida, seguita da eluizione degli analiti e MS misura7,8 , 9 , 10. con immuno-arricchimento, gli analiti sono purificati da campioni complessi e pertanto sono ridotti al minimo gli effetti di ioni-soppressione da altre molecole. Tra i vari supporti solidi, biglie magnetiche attualmente sono più ampiamente usati come hanno i vantaggi della capacità di legame dell’anticorpo alta e maneggevolezza. Biglie magnetiche con diverse funzionalizzazioni e dimensioni sono stati sviluppati e commercializzati per esperimenti di immunoprecipitazione. Fin qui, immuno-arricchimento su perline è stato interfacciato con MALDI-MS e ionizzazione electrospray (ESI) per la misurazione della proteina e del peptide. Isotopo stabile standard e la cattura di tecnologia di anticorpi anti-peptide (SISCAPA), proteine nei campioni sono digeriti, seguita da incubazione con anticorpo-rivestite di perline per immuno-arricchimento. In SISCAPA “classica”, i peptidi proteotypic catturati sono eluiti dalle perline e misurati da liquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), o infusione diretta ESI multiplo reazione monitoraggio-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-arricchimento migliorata la sensibilità del dosaggio MRM di 3-4 ordini di grandezza, raggiungendo la fascia bassa ng/mL13.
Rispetto a MS di electrospray, MALDI-MS è più veloce e non comporta la pulizia e il riequilibrio delle colonne LC così non ci sono problemi riporto e contaminazione, rendendolo più adatto per studi di alto-rendimento14. Immuno-MALDI tecnologia è stata sviluppata nel nostro laboratorio di combinare immuno-arricchimento con MALDI-MS per quantificazione sensibile e specifica di peptidi e proteine (basate sulla quantificazione dei peptidi proteotypic)15,16 ,17. Dopo immuno-arricchimento, le perle sono depositate su un piatto di destinazione MALDI, la soluzione di matrice viene aggiunta di perline e il piatto è pronto per l’analisi di un MALDI-TOF-MS dopo l’essiccazione. Eluizione dei peptidi dalle perline non viene eseguita come un passaggio separato, ma associato a affinità analiti sono eluiti dalla soluzione MALDI matrice quando viene aggiunto ai punti tallone, quindi semplificare la preparazione del campione e minimizzazione della perdita di campione. La tecnologia iMALDI è stata applicata in una varietà di applicazioni18,19e recentemente è stata automatizzata e utilizzata per la misurazione dell’angiotensina I (Ang ho) per la determinazione della renina del plasma attività (PRA)20. Questo protocollo sarà dimostrare la procedura utilizzata per eseguire un test automatizzato iMALDI. Prendendo il test PRA come esempio, Inter-giorno CVs di meno del 10% sono stati raggiunti grazie all’automazione, con la capacità di misurare 744 campioni al giorno20.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo manoscritto non richiede la digestione di proteine, come la molecola bersaglio (Ang ho) è un peptide con un peso molecolare di 1295.7 Da. In altri saggi cui digestione delle proteine è necessaria e un peptide è utilizzato come surrogato per la proteina intatta, il peptide selezionato per iMALDI deve essere univoco e specifico per la proteina dell’obiettivo, con una massa oltre 800 Da così che esso può essere facilmente distinto dal c hemical rumore dalla soluzione matrice MALDI. Gli anticorpi anti-peptide sono necessari per l’immuno-arricchimento dei peptidi. Il protocollo per un dosaggio di iMALDI PRA di misura è costituito da quattro fasi: 1) generazione di Ang I nel plasma umano; 2) immuno-arricchimento di Ang che usando le perle di anticorpo-rivestite; 3) trasferimento di perline a una piastra MALDI e aggiungendo soluzione matrix; e 4) acquisizione del segnale con una di analisi dati e MALDI-TOF-MS20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l’immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell’anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l’Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l’utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. e C.H.B. sono grato per il sostegno del Warren Y. Soper Charitable Trust e la Fondazione di famiglia di Alvin Segal per l’ospedale generale ebreo (Montreal, Quebec, Canada).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
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