Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System
Summary
Denne protokollen beskriver stabilisering av oksygennivået i en liten mengde resirkulert buffer og metodologiske aspekter ved opptak aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet i neddykket akutt hippocampus skiver.
Abstract
Selv om eksperimenter på hjernen stykker har vært i bruk siden 1951, fortsatt problemer som reduserer sannsynligheten for å oppnå en stabil og vellykket analyse av synaptic overføring modulering når potensielle eller intracellulær andre. Dette manuskriptet beskriver metodiske aspekter som kan være nyttig i å forbedre eksperimentelle forhold for vedlikehold av akutt hjernen skiver og opptak feltet eksitatoriske postsynaptic potensialer i en kommersielt tilgjengelig neddykking kammer med en strøm-carbogenation enhet. Strøm-carbogenation bidrar til å stabilisere oksygennivået eksperimenter som bruker resirkulering av en liten buffer reservoaret for å forbedre kostnadseffektiviteten av stoffet eksperimenter. I tillegg presenterer manuskriptet representant eksperimenter undersøke effekten av ulike carbogenation moduser og stimulering paradigmer på aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet av synaptic overføring.
Introduction
I 1951 ble første rapporterte akutte hjernen stykke eksperimenter utført1. I 1971, etter vellykket i vitro opptak fra piriform cortex2,3 og funnet at hippocampus neurons er sammenvevd tvers langs septotemporal akse hippocampus4, en av de første i vitro opptak av hippocampus neuronal aktivitet var oppnådd5. Likheten av parameterne nevrofysiologiske eller neurostructural av neurons under i vivo og i vitro forhold er fortsatt gjenstand for noen debatt6, men i 1975, Schwartzkroin7 indikerte at de basale egenskaper av neurons opprettholdes i vitro og den høyfrekvente stimulering (dvs. tetanization) afferente i hippocampus formasjonen induserer en langvarig tilrettelegging av synaptic potensialer8. Elektrofysiologiske opptak av neuronal aktivitet i vitro kraftig utvidet studiet av cellulære mekanismer for aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet9,10, som hadde blitt oppdaget i 1973 av Bliss et al. 11 i vivo eksperimenter med kaniner.
Studiet av neuronal aktivitet eller signalnettverk trasé i hjernen skiver, og særlig i akutt hippocampus skiver, er nå et standardverktøy. Men overraskende, har i vitro eksperimenter ennå å bli standardisert, som dokumentert av flere tilnærminger som fortsatt eksisterer og vedlikehold av akutt hippocampus skiver. Reid et al. (1988) 12 gjennomgått metodiske utfordringer for vedlikehold av akutt hjernen sektorer i ulike typer skive kamre og valg av bading medium, pH, temperatur og oksygen nivå. Disse parametrene er fortsatt vanskelig å kontrollere i innspillingen kammer på grunn av skreddersydde elementer av i vitro skive-opptak oppsett. Publikasjoner kan bli funnet som kan bidra til å overvinne noen metodiske utfordringer og som beskriver nye typer neddykking skive chambers, som en interstitiell 3D microperfusion system13, et kammer med forbedret laminær strømning og oksygen Angi14, et system med datastyrt temperatur kontroll15og en multi kammer innspilling system16. Siden disse rommene ikke er lett å bygge, stole de fleste forskere på kommersielt tilgjengelig skive kamre. Disse rommene kan monteres på et mikroskop system, slik at for kombinasjonen av electrophysiology og fluorescens imaging17,18,19. Siden disse rommene holde hjernen skiver neddykket i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), må en høy flow rate i buffer løsning opprettholdes, øke bekostning av medikament programmet. Dette har vi innarbeidet en resirkulering perfusjon system med strøm-carbogenation som gir tilstrekkelig stabilitet for langsiktig opptak av feltet potensialer i en neddykking skive kammer med et relativt lite aCSF volum. I tillegg oppsummert vi hvordan bruk av eksperimentell carbogenation/perfusjon systemet påvirker resultatet av aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet10 og hvordan hemming av eukaryote forlengelse faktor-2 kinase (eEF2K) modulerer synaptic overføring20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om grensesnittet skive kamre utstilling mer robust synaptic svar25,26,27,28, gir neddykking chambers ekstra praktisk for patch-klemme opptak og fluorescens bildebehandling. Derfor har vi beskrevet flere aspekter av potensielle feltopptak i akutt hippocampus skiver med en kommersiell neddykking skive kammer som kan enkelt utvides til avbilding av fluorescens sonder neurons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ww gjennomført, analysert, og designet eksperimenter og skrev manuskriptet. D.X. og C.P. assistert figur forberedelse og gjennomført eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NSFC (31320103906) og 111 Project (B16013) TB
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
