Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem
Summary
Det här protokollet beskriver stabiliseringen av syrehalten i en liten volym av återvunnet buffert och metodologiska aspekter av inspelning aktivitet-beroende synaptisk plasticitet i nedsänkt akut Hippocampus skivor.
Abstract
Även om experiment på hjärnan skivor har varit i bruk sedan 1951, kvarstår problem som minskar sannolikheten för att uppnå en stabil och framgångsrik analys av synaptisk transmission modulering när du utför potentiella eller intracellulära fältinspelningar. Detta manuskript beskriver metodologiska aspekter som kan vara till hjälp att förbättra experimentella förhållandena för underhåll av akut hjärnskada skivor och för att registrera fält excitatoriska postsynaptiska potentialer i en kommersiellt tillgänglig nedsänkning kammare med ett utflöde-carbogenation enhet. Den utflöde-carbogenation hjälper till att stabilisera syrenivån i experiment som förlitar sig på återvinning av en liten buffert reservoar att förbättra kostnadseffektiviteten av drogen experiment. Dessutom presenterar manuskriptet representativa experiment att undersöka effekterna av olika carbogenation lägen och stimulering paradigm på aktivitet-beroende synaptisk plasticitet av synaptisk transmission.
Introduction
1951 var första rapporterade akuta hjärnan slice experimenten bedrivs1. 1971, efter framgångsrika in vitro- inspelningar från piriform cortex2,3 och upptäckten att Hippocampus nervceller är sammankopplade tvären längs septotemporal axeln av hippocampus4, en av de första in vitro -inspelningar av hippocampus neuronal aktivitet var uppnådda5. Likheten mellan de neurofysiologiska eller neurostructural parametrarna av nervceller i vivo och in vitro- villkor är fortfarande föremål för någon debatt6, men 1975, Schwartzkroin7 indikerade att den basala egenskaper av nervceller underhålls i vitro och att högfrekvent stimulering (dvs. tetanization) av afferenter i hippocampus bildandet inducerar en långvarig underlättande av synaptic potentialer8. Elektrofysiologiska inspelning av neuronal aktivitet in vitro- kraftigt expanderat studiet av de cellulära mekanismerna av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet9,10, som hade upptäckts i 1973 av Bliss o.a. 11 i i vivo experimenterar med kaniner.
Studien av neuronal aktivitet eller signalering vägar i hjärnan skivor, och särskilt i akuta Hippocampus skivor, är nu ett standardverktyg. Överraskande, har in vitro- försök dock ännu skall standardiseras, vilket framgår av de flera metoder som fortfarande finns för förberedelser och upprätthållande av akut Hippocampus skivor. Reid et al. (1988) 12 recenserade de metodologiska utmaningarna för underhåll av akut hjärnskada skivor i olika typer av slice chambers och val av badningen medium, pH, temperatur och syre nivå. Dessa parametrar är fortfarande svåra att kontrollera i inspelning kammaren på grund av de måttbeställda delarna av in vitro- slice-inspelning uppställningar. Publikationer kan hittas att kanske hjälp att övervinna några av de metodologiska utmaningarna och som beskriver nya typer av nedsänkning slice chambers, såsom en interstitiell 3D microperfusion system13, en kammare med förbättrad laminärt flöde och syre leverera14, ett system med datoriserad temperatur kontroll15och en multi chamber inspelning system16. Eftersom dessa kamrar inte är lätt att bygga, de flesta forskare förlitar sig på kommersiellt tillgängliga slice chambers. Dessa kammare kan monteras på en Mikroskop system, vilket möjliggör kombinationen av elektrofysiologi och fluorescens imaging17,18,19. Eftersom dessa kamrar hålla hjärnan skivor nedsänkt i konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), behöver en hög flödeshastighet av buffertlösningen underhållas, ökar på bekostnad av drogen ansökan. Därför har vi bildat ett återvinningssystem perfusion med utflöde-carbogenation som ger tillräcklig stabilitet för långsiktiga inspelning av fältet potentialer i en nedsänkning slice kammare med en relativt liten aCSF volym. Dessutom sammanfattat vi hur användningen av detta experimentella carbogenation/perfusion system påverkar resultatet av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet10 och hur hämning av eukaryota elongation factor-2 tyrosinkinashämmare (eEF2K) modulerar synaptic överföring20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om gränssnittet slice chambers uppvisar mer robust synaptic Svaren25,26,27,28, ger nedsänkning chambers ytterligare bekvämlighet för patch-clamp inspelning och fluorescens Imaging. Således har vi beskrivit flera aspekter av potentiella fältinspelningar i akut Hippocampus skivor med hjälp av en kommersiell nedsänkning slice kammare som kan enkelt förlängas till avbildning av fluo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WW genomfördes, analyseras, och utformade experiment och skrev manuskriptet. D.X. och C.P. biträtt i figur förberedelse och genomfört experimenten. Detta arbete stöds av NSFC (31320103906) och 111 Project (B16013) att T.B.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
