Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat
Summary
Hier presenteren we een verfijnde protocol om effectief biotinyleerd dextran amine (BDA) labelen met een fluorescerende vlekken methode via een wederzijdse neurale traject weer te geven. Het is geschikt voor het analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen onder een confocale laser scanning microscoop.
Abstract
Ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd dextran amine (BDA) heeft als een hooggevoelige neuroanatomische tracer gebruikt voor vele decennia. Aangezien de kwaliteit van haar labeling werd beïnvloed door verschillende factoren, hier, bieden wij een verfijnde protocol voor de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA voor het bestuderen van de optimale neurale labelen in het centrale zenuwstelsel. Na de stereotactische injectie van BDA in de kern van de ventrale posteromedial (VPM) van de thalamus in de rat door middel van een fijne glazen pipet, was de BDA gekleurd met fluorescerende streptavidine-Alexa (AF) 594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525. Op de achtergrond van de groene Nissl kleuring, werd de rode BDA labeling, met inbegrip van de neuronale cel organen en axonale terminals, meer duidelijk aangetoond in de Somatosensorische cortex. Bovendien Dubbel fluorescerend kleuring voor BDA en de calcium-bindende eiwit parvalbumin (PV) werd uitgevoerd om te observeren van de correlatie van BDA labeling en PV-positieve interneuronen in de corticale doelgroep, bieden de mogelijkheid om te studeren van de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken. Dus, deze verfijnde methode is niet alleen geschikt voor het visualiseren van hoge kwaliteit neurale labelen met het hoge molecuulgewicht BDA via wederzijdse zenuwbanen tussen de thalamus en cortex cerebri, maar ook toestaat de gelijktijdige demonstratie van andere neurale markeringen met fluorescerende histochemie of Immunochemie.
Introduction
Ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 moleculair gewicht), een zeer gevoelige tracer, is gebruikt voor het traceren van de zenuwbanen in het centrale zenuwstelsel voor meer dan 20 jaar1. Hoewel het gebruik van de BDA een gemeenschappelijk neurale tract traceren techniek is, kan de kwaliteit van het BDA labeling in dieren worden beïnvloed door verschillende factoren1,–2,3. Onze recente onderzoek is gebleken dat de optimale structuur van BDA labeling is niet alleen een goede na injectie overlevingstijd is gekoppeld, maar ook gecorreleerd met de kleuring methode4. Tot nu, conventionele avidin-Biotine-peroxidase complex (ABC) en daar-fluoresceïne isothiocyanaat streptavidine-AF594 werden kleuring methoden gebruikt voor het openbaren van de BDA labeling in eerdere studies2,3, 4,5. In vergelijking, kan fluorescerende vlekken voor BDA worden eenvoudig uitgevoerd.
Oog op de uitbreiding van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA, was een geraffineerde protocol van Madrid introduceerde in de huidige studie. Na de injectie van BDA in de VPM van de thalamus in de rat hersenen werd BDA labeling geopenbaard door de gewone methode van het standaard ABC kleuring en dubbele fluorescerende vlekken, die werd uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en basic neurale elementen of interneuronen in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en fluorescerende Nissl histochemie of PV-Immunochemie, respectievelijk. Door de wederzijdse zenuwbanen tussen VPM en de primaire Somatosensorische cortex (S1)6,7,8, we gericht onze waarneming op BDA labelen in de axonen van het thalamocortical geprojecteerd en corticothalamic geprojecteerde cel Soma in de S1. Door dit proces moeten wij bieden niet alleen een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van de hoge kwaliteit van neurale labelen met ultrahoog moleculair gewicht BDA, maar ook een geraffineerde protocol betreffende de combinatie van fluorescent BDA labeling en andere tl neurale markeringen met histochemie of Immunochemie. Deze aanpak verdient de voorkeur om de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken onder een confocale laser scanning microscopie te studeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het selecteren van een juiste tracer is een cruciale stap voor een succesvolle neurale tracering experiment. In de familie van de BDA, ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 molecuulgewicht) werd aanbevolen bij voorkeur worden vervoerd via het traject anterograde neurale in tegenstelling tot laag molecuulgewicht BDA (3.000 molecuulgewicht)2,3 , 11 , 12 , 13….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door het National Natural Science Foundation of China (Project Code no. 81373557; nr. 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. 신경과학. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
