Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat
Summary
Nous présentons ici un protocole raffiné pour révéler efficacement amine de dextran biotinylé (BDA) marquage avec une fluorescence coloration méthode via une voie neurale réciproque. Il est adapté pour l’analyse de la structure fine des BDA étiquetage et qui le différencient des autres éléments neurones sous un confocal laser scanning microscope.
Abstract
Amine de haut poids moléculaire biotinylé dextran (BDA) a été utilisé comme traceur neuroanatomique très sensible pendant de nombreuses décennies. Étant donné que la qualité de son étiquetage a été affectée par divers facteurs, ici, nous fournissons un protocole raffiné pour l’application de poids moléculaire élevé BDA pour l’étude de marquage neuronal optimal dans le système nerveux central. Après injection stéréotaxique du BDA dans le noyau de la périostite ventrale (VPM) du thalamus chez le rat par une pipette de verre délicat, BDA a été souillé avec fluorescent streptavidine-Alexa (AF) 594 et Eosine avec coloration de Nissl fluorescente AF500/525. Sur le fond de coloration de Nissl vert, le rouge BDA étiquetage, y compris des corps cellulaires neurones et terminaux d’axonal, a été démontrée plus distinctement dans le cortex somatosensoriel. En outre, double coloration fluorescente pour BDA et la parvalbumine de protéine liant le calcium (PV) a été réalisée pour observer la corrélation du BDA étiquetage et interneurones PV positif dans la cible corticale, fournissant l’occasion d’étudier le local neural circuits et leurs caractéristiques chimiques. Ainsi, cette méthode raffinée est non seulement appropriée pour la visualisation de neurones marquage avec la masse moléculaire élevée BDA à travers les voies nerveuses réciproques entre le thalamus et le cortex cérébral de haute qualité, mais permettra également à la manifestation simultanée de autres marqueurs neurones avec histochimie fluorescent ou immunochimie.
Introduction
Poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000), un traceur très sensible, a été utilisé pour tracer des voies nerveuses dans le système nerveux central pour plus de 20 ans1. Bien que l’utilisation de la BDA est une commune étendue neurale suivi technique, la qualité de l’étiquetage de la BDA peut être affectée chez les animaux par divers facteurs1,2,3. Notre étude récente révèle que la structure optimale de l’étiquetage de la BDA est non seulement associée à un moment approprié de survie après l’injection, mais aussi en corrélation avec la coloration méthode4. Jusqu’à présent, classique complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC), streptavidine-fluorescéine isothiocyanate et streptavidine-AF594 méthodes de coloration ont été utilisées pour révéler l’étiquetage BDA dans précédentes études2,3, 4,5. En comparaison, une coloration fluorescente pour BDA peut être facilement effectuée.
Afin d’étendre l’application de poids moléculaire élevé BDA, un protocole raffiné a été introduit dans la présente étude. Suite à l’injection de BDA dans le VPM du thalamus dans le cerveau de rat, BDA d’étiquetage a été révélée par la méthode habituelle de souillure d’ABC standard ainsi que par la double coloration fluorescente, qui a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et base les éléments neurones ou interneurones dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et fluorescent Nissl histochimie ou PV-immunochimie, respectivement. Par le biais de voies neurales réciproques entre le VPM et le cortex somatosensoriel primaire (S1)6,7,8, nous avons concentré notre observation sur BDA étiquetage dans les axones thalamocortical projeté et corticothalamiques somas cellule projetée dans le S1. Par ce processus, nous nous attendions à fournir non seulement un protocole détaillé pour l’obtention de la qualité de marquage neuronal à haut poids moléculaire BDA, mais aussi un protocole raffiné sur la combinaison de marquage fluorescent de BDA et d’autres marqueurs neurones fluorescents avec histochimie ou immunochimie. Cette approche est préférable d’étudier les circuits neurones locaux et leurs caractéristiques chimiques sous un laser confocal, microscopie à balayage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sélection d’un bon traceur est une étape essentielle pour une expérience réussie de traçage neuronal. Dans la famille de BDA, poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000) a été recommandé à transporter préférentiellement par le biais de la voie neuronale antérograde contrairement à faible poids moléculaire BDA (3 000 poids moléculaire)2,3 , 11 , 12 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (projet Code n° 81373557, n° 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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