제자리에서 Shewanella oneidensis MR1 Biofilms SALVI 및 ToF 심즈의 특성

요약

이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.

초록

박테리아 biofilms는 그는 광대 하 게 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 및 환경 미생물학에서 그들의 역할을 이해 하는 표면에 관련 된 지역 사회. 이 연구는 분석 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에 대 한 시스템에 biofilm 첨부 파일을 육성하 고 생활 biofilm의 화학 매핑 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈)에 의해 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 외부와 우리의 전문 설치 SALVI 채널 내의 박테리아의 경작을 통해 뿐만 아니라 biofilm 존재 및 ToF 심즈 분석 전에 두께 감지 하는 광학 이미징 기술을 통해 이루어집니다. 조각 같은 biofilm에서 크게 다른 탈수의 지역화 된 물 클러스터 환경으로 EPS에 강조 우리의 결과, 자연 수 화 상태에서 Shewanella biofilm의 특성 피크를 보여 상태입니다. 이러한 결과 진공 기반 화학 이미징 장비 biofilm 이미징 제자리에 있도록 SALVI의 획기적인 기능을 보여 줍니다.

서론

박테리아 biofilms는 점에서 셀 연결 하 고 많은 가능한 환경에서 살아남을 수 있다 불리 한 물리적 및 기계적 자극, 다양 한 생존을 위해 박테리아에 대 한 방어로 시간이 지남에 진화 표면 관련 커뮤니티. ^{1 , 2} Biofilms는 광대 하 게 조사 하 고 의학, 공학, 농업, 그리고 산업 연구 및 개발 등 많은 분야에 응용 프로그램을. ^{1 , 2} 정확 하 필수적 이다 이러한 복잡 한 미생물 지역 사회, 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS)와 그들의 현지 물-클러스터 환경 등의 화학 매핑을 이해 하 고 상세한 그들의 생물 학적 활동 묘사 ²

Biofilms는 존재 하 고 높은 수 화 상태에서 성장. 이 진공에서 휘발성 액체를 공부에 어려움으로 인해 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈) 같은 진공 기반 표면 분석 기법을 사용 하 여 큰 도전을 선물 한다. 그 결과, 진공 기반 표면 분석 기법만 말린된 상태에서 biofilm 샘플을 공부 하 고 거의 독점적으로 제....

프로토콜

1. 재료의 준비

1. 준비의 중간 튜브
   1. (biofilm 문화와 성장 곡선 당 필요한 3 당 필요 1) 혈 청 병
      참고: 어떤 성장 든 지 소개에서 설명 했 듯이 이 절차에 대 한 관심의 박테리아의 변형에 필요한 영양분을 제공 하는 적합 한 매체를 이용 될 수 있다 이 경우에, " 나노 와이어 " 미디어와 포도 당 매체 없이 TSB S. oneidensis 씨 1 GFP의 성장을 위해 사용 되었다. ¹³
      1. 보증금 20 mL로 한 70 mL 혈 청 병, 성장 매체의 마 개 모자 그리고 병을 방해. 살 균 깨끗 한 알루미늄 호 일의 조각으로 상단 커버.
      2. 압력솥 121에서 30 분 동안 액체 주기 병 ° C. Afterward, 저장 실내 온도에서 살 균된 혈 청 병.
   2. 혐 기성 문화 관
      1. 공기 headspace와 혐 기성 문화 관으로 성장 매체의 5 mL을 입금 마 개에 넣고 병을 방해. 살 균 호 상단 커버.
2. 거품 트랩 튜브 준비
   1. 신중 하 게 혈 청 병 고무 마 개를 ....

결과

이러한 대표적인 결과 ToF 심즈를 통해 연결 된 biofilm의 화학 프로필 수 식별 및 해석 하는 방법을 보여을 제공 합니다. ToF 심즈 데이터 수집, 절차 섹션에서 짧게 강조에서 질량 스펙트럼을 플로팅 후 피크 식별 각 각각 m/z 값에는 id를 지정 하려면 실시 한다. 이것은 박테리아와 공부, 등 다양 한 물 클러스터, 지방산, 단백질 조각 박테리아 내에서 있을 것으로 예상 되는 특정 화학 조각에 질량 분석에 광범위 한 문학 검토를 통해 행 해질 수 있다. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} 이 대표적인 결과 표시 부정적인 질량 스펙트럼으로 S. oneidens.......

토론

로그 단계에서 접종 후 수 일 및 온도를 그것은 건강 하 고 이미징, 충분히 두꺼운 3.1 단계에서 설명한 대로 전에 biofilm 성장 해야 테스트 중요 하다. 이 절차는 특히 S. oneidensis MR1 biofilm; 실 온에서 배양 커버 그러나 다른 방 온도 성장의 속도 좌우할 수 있다. 따라서, 그것은를 사용 하 여 광학 이미징는 biofilm ToF 심즈 분석을 진행 하기 전에 준비 인지 이해 중요 합니다. 마찬가지로, 박테리아의 다른 변종 다른 성장 조건 및 분석에 대 한 바람직한 두께 달성 하는 길이 필요 합니다. 그림 1b에서 성장 곡선 묘사 될 12-32 h, 박테리아의 로그 단계 200 하 고이 절차를 통해 24 시간에 사용 되었다, 그러나 그것은이 시간으로 사용할 수 없습니다 로그 단계 박테리아의 다른 변종에 대 한 성장 곡선을 설정 하지 않고 독립적으로. 로그 단계 S. oneidensis에 대 한 성장의 12와 33 h 사이 동안, 24 h 사실은 그것이 산소 로그 단계의 끝으로 생물의 성장 율을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ToF-SIMS	IONTOF	TOF. SIMS 5	해상도 : >10,000 m /&델타; 질량 분해능의 경우 m; >4,000m/&델타; m for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	퍼시픽 노스웨스트 국립 연구소	N/A	SALVI는 비행 시간 2차 이온 질량 분석기(ToF-SIMS)와 같은 진공 기반 과학 기기가 분자 수준에서 자연 상태의 액체 표면을 분석할 수 있도록 하는 독창적인 독립형 휴대용 분석 도구입니다.
-80° C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 프리미엄 에너지 효율적인 초저온 냉동고
4° C 냉장고	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
오비탈 셰이커	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 다층 환경 셰이커, 혈청 병 및 플라스크 배양을 위해 섭씨 30도로 설정, 150rpm으로 설정.
주사기 펌프	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer 주사기 펌프, 주입 전용, 터치스크린 제어 74905-02, 일정한 유속으로 튜브 시스템 및 SALVI에 액체를 주입하는 데 사용됩니다.
인큐베이터	Barnstead International	LT1465X3	랩라인 인큐베이터로, 플레이트 배양을 위해 섭씨 30도로 설정됩니다.
오토클레이브	Getinge	533LS	PEEK 피팅, 튜빙 시스템, 혈청 바이알 및 매체를 멸균하는 데 사용됩니다. 모델 533LS 진공 증기 살균기
분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 분광 광도계는 성장 곡선을 위한 큐벳의 OD600 판독값을 위한 것입니다.
생물 안전 캐비닛	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 시리즈 AZ 생물 안전 캐비닛
형광 현미경	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 형광 현미경(카메라 및 초고압 수은 램프 전원 공급 장치 포함).
pH 측정기	Mettler Toledo	51302803	pH를 테스트하는 데 사용됩니다. 나노 와이어" 완성되는 후에 그리고 압력가마로 소독하기 전에 매체.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	SALVI의 입구와 출구, 주사기를 튜빙 시스템에 연결하고 SALVI의 입구를 튜빙 시스템의 드립 챔버에 연결합니다.
5 축 샘플 스테이지	IONTOF	N / A	스테이지는 ToF-SIMS에 SALVI를 장착하기 위해 자체 제작되었습니다.
Barnstead 나노 순수 정화 시스템	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP 역삼투 여과 모듈(D2716)
피펫	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	범위: 100 - 1,000 &마이크로;L.
피펫 팁	Neptune	2112.96.BS	1,000 µ L 피펫 팁
면도날 핸들	Stanley	N/A	Stanley Bostitch 면도날 스크레이퍼(5개의 단일 모서리 블레이드 포함), PTFE 튜브
주사기	BD	309659	1mL
주사기	BD	309657	3mL
주사기	BD	309646	. 드립 챔버
사기	BD	309604	10 mL
주사기	BD	302830	20 mL
일회용 피펫	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ 메니파이어 스트라이프가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫, 혈청 병을 채우기 위해.
전기 피펫 필러	Pipet-aid	P-57260	진공 압력 전기 혈청학적 피펫 필러
세럼 병	Sigma	33109-U	배양 성장을 위해 약 69mL의 액체를 담을 수 있으며, 병당 20mL 배양을 사용하는 데 최적입니다.
혐기성 배양 튜브	VWR	89167-178	혐기성 튜브, 18 x 150mm, 20mm 블루 부틸 고무 마개 및 알루미늄 씰과 함께 제공됩니다.
고무 마개	Sigma	27235-U	실리콘 마개는 세럼 병을 밀봉하고 튜빙 시스템/드립 챔버를 만드는 데 사용됩니다.
알루미늄 크림프 씰(격막 제외)	Sigma	27227-U	세럼 병 상단용 알루미늄 씰, 세럼 병 크림퍼와 함께 사용.
세럼 병 알루미늄 씰 크림퍼	Wheaton	224307	표준 씰이 있는 30mm 크림퍼.
PTFE 튜빙	Supelco	58697-U	1.58mm OD x 0.5mm ID 50피트 PTFE 테프론 튜빙, 튜빙 시스템 생성에 사용됩니다.
일회용 큐벳	GMBH	759085D	분광 광도계와 함께 사용하기 위한 1.5 Ml.
바늘	BD	303015	22G; 혈청 병 주입에 사용됩니다.
바늘	BD	305120	23G; 드립 튜빙 시스템을 만들기 위해 펀칭 스루 고무 마개에 사용됩니다.
N/A	N/A	가 있는 Shewanella oneidensis MR-1	Goodman AE (1996) 대장균 이외의 그람 음성 박테리아에 사용하기 위한 GFP 벡터의 구축. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
에탄올	써모 피셔 사이언티픽	S25310A	95% 변성
TSA	BD	212305	이 프로토콜에 사용되는 모델 유기체(S. oneidensis) 배양을 위한 트립틱 대두 한천
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	" 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
수산화나트륨	시그마	S-5881	" 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
염화암모늄	시그마	A-5666	" 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
염화칼	시그마	P-4504	" 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
인산나트륨 일염기성	시그마	S-9638	" 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
염화나트륨	Thermo Fisher Scientific	S271-3	" 나노 와이어" 매체, 그리고 "를 위해 이용된 무기물 해결책을 만들기 위하여 이용되는 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
젖산나트륨		Sigma L-1375	60%(w/w) 시럽 @ 98% 순수, d=1.3 g/mL, 7M, " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	철 NTA 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
니트릴로트리아세트산 트리소듐 염	시그마	N-0253	철 NTA 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
철(III) 염화물	시그마	451649	철 NTA 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
황산 마그네슘	시그마	208094	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
망간(II) 황산염 일수화물	시그마	M-7634	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
코발트(II) 염화물	시그마	60818	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
염화아연	시그마	229997	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
구리(II) 황산염 펜타하이드레이트	시그마	C-8027	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
알루미늄 칼륨 황산염 Dodecahydrate	Sigma	237086	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
몰리브덴산나트륨 이수화물	시그마	331058	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
니켈(II) 염화물	시그마	339350	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
텅스텐 산 나트륨 이수화물	시그마	14304	미네랄 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
엽산	시그마	F-7876	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
피리독신 염산염	시그마	P-9755	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
리보플라빈(B2)	시그마	47861	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
티아민 염산염	시그마	T-4625	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
니코틴산	시그마	N4126	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
D-판토텐산 헤미칼슘염	시그마	21210	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 중간 {Hill, E.A. 2007}
비타민 B12	시그마	V-2876	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	비타민 용액을 만드는 데 사용되며 " 나노 와이어" 매체 {Hill, E.A. 2007}

5mL 절단에 사용됩니다 주GFP Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC륨