En genetisk manipuleret musemodel af sporadisk kolorektal cancer
Summary
En protokol til etablering af en genetisk manipuleret musemodel af kolorektal cancer ved segmenteret adeno-cre-infektion og dens overvågning via højopløsnings-koloskopi præsenteres.
Abstract
På trods af fordelene ved let anvendelighed og omkostningseffektivitet har muskelmodeller med kolorektal cancer baseret på tumorcelleinjektion alvorlige begrænsninger og simulerer ikke nøjagtigt tumorbiologi og tumorcelleformidling. Genetisk manipulerede musemodeller er blevet introduceret for at overvinde disse begrænsninger; Imidlertid er sådanne modeller teknisk krævende, især i store organer som tyktarmen, hvor kun en enkelt tumor ønskes.
Som et resultat heraf blev der udviklet en immunokompetent, genetisk manipuleret musemodel af kolorektal cancer, der udvikler stærkt ensartede tumorer og kan anvendes til tumorbiologi studier samt terapeutiske forsøg. Tumorudvikling initieres ved kirurgisk, segmental infektion i det distale kolon med adeno-cre-virus i sammensatte betingede mutante mus. Tumorerne kan let registreres og overvåges via koloskopi. Her beskriver vi den kirurgiske teknik for segmental adeno-cre infektion afTyktarmen, overvågningen af tumoren via højopløsningskolonoskopi og præsenterer de resulterende kolorektale tumorer.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) er fortsat en af de førende årsager til kræftrelateret død i vestlige lande. 1 Mens prognosen hos patienter med tidlig stadium sygdom er god, diagnosticeres mange tumorer i senere stadier, hvor prognosen på trods af mange behandlingsmuligheder er begrænset. 2 , 3 , 4 , 5
Størstedelen af nuværende musemodeller af CRC er baseret på implantering af tumorceller afledt fra cellelinier eller patienttumorer i immunodeficiente mus. 6 , 7 , 8 Dette fører til lokal og, afhængigt af injektionsstedet og tumorcellerne, der anvendes til injektion, undertiden metastatiske tumorer. 9 , 10 Imidlertid har de resulterende xenograftmodeller majoR begrænsninger. De skal etableres i immunodeficiente mus og eliminerer således den komplekse interaktion mellem tumor og værtsimmunsystemet. Da tumorstroma er afledt fra værtsceller, er interaktionen mellem humant tumorparenchyma og murin stroma desuden defekt og derfor ikke repræsentativ for sygdommen. Disse mangler kan undgås ved anvendelse af murine cellelinjer til injektion. Imidlertid er kun få muse-CRC-cellelinier tilgængelige, og som de fleste tilgængelige humane CRC-cellelinier er monoklonale og stærkt anaplastiske. 11 Sammenfattende er de fleste tilgængelige CRC-musemodeller meget kunstige og ikke fuldt repræsentative for den menneskelige sygdom.
Genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er) af CRC kan undgå disse ulemper, da de har ægte musetumorer, som skabes via induktion af vigtige mutationer af CRC i tyktarmen. 12 , 13 ,14 Dette kan opnås ved aktivering af betingede (floxed) kimline-mutationer ved cre recombinase inden i den kolorektale slimhinde. Selvom der i GEMM'er fra mange andre tumorenheder anvendes germline (inducerbar) cre-ekspression drevet af vævsspecifikke promotorer, kan germline cre ikke anvendes i tyktarmen, da dette fører til et stort antal adenomer i hele tyktarmen, hvilket forårsager død ved godartet tumorbelastning ved En meget ung alder. Derfor anvendes i den her beskrevne model en adenoviral vektor-udtrykkende cre til at inficere et kort tyktarmsegment. Dette fører til induktion af tumorigenese inden for dette segment af slimhinden på et tidspunkt defineret af undersøgeren, hvilket resulterer i adenomer i sidste ende udvikler sig til invasiv og metastatisk carcinom. Tumorerne er ægte musetumorer, vokser i et intakt mikromiljø og kan derfor simulere hele den kolorektale onkogenese, herunder tumor-værtsinteraktion og metastatisk kaskade. Denne model erDerfor en attraktiv platform for studier af kræftbiologi og prækliniske terapeutiske forsøg.
En stor ulempe ved genmodificerede musemodeller af CRC er deres tekniske kompleksitet. Lokal cre-afgivelse ved anvendelse af rektale adeno-cre-enemaser i mus, der bærer floxede Apc-alleler, er tidligere blevet beskrevet; Imidlertid kan forekomsten, multipliciteten og placeringen af tarmtumorerne være meget variabel med denne teknik. Derfor er teknikken til at begrænse adeno-cre-infektionen ved kirurgisk klemning af det segment, der skal induceres, blevet udviklet. 13 Vi har ændret denne procedure for at forbedre dyrevelfærden samt reducere dødeligheden og antallet af resulterende tumorer. Med denne protokol skal alle laboratorier med erfaring i lille gnaveroperation være i stand til at reproducere modellen og producere tumorer, som er meget reproducerbare og let tilgængelige for koloskopi. Afhængigt af den betingede mUdstillinger anvendt til tumorigenese, det fulde spektrum af adenom, invasiv karcinom og metastaser kan observeres. Da tumorerne er placeret i det distale kolon, er seriel endoskopisk vurdering let mulig i denne model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens de generelt er nemme at generere og vedligeholde, er klassiske CRC-musemodeller baseret på cellelinjinsprøjtning kunstige og kan ikke fuldt ud rekapitulere den menneskelige sygdom. Som følge heraf er GEMM'er blevet udviklet. Den første CRC GEMM var Apc Min- musen, som har en heterozygot null-mutation i Apc-genet, og efterligner derfor den menneskelige arvelige sygdom familiel adenomatøs polyposis (FAP). 21 Apc Min- mus udvikler dog altid flere intestinale adeno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er dedikeret til hukommelsen til professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
