Un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal sporadique
Summary
Un protocole pour l'établissement d'un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal par une infection segmentaire adeno-cre et sa surveillance par coloscopie à haute résolution est présentée.
Abstract
Malgré les avantages d'une applicabilité et d'une rentabilité faciles, les modèles de souris cancéreuses basées sur l'injection de cellules tumorales ont des limites sévères et ne simulent pas exactement la biologie tumorale et la diffusion de cellules tumorales. Des modèles de souris génétiquement modifiés ont été introduits pour surmonter ces limitations; Cependant, ces modèles sont techniquement exigeants, en particulier dans les grands organes tels que le côlon dans lequel une seule tumeur est souhaitée.
En conséquence, un modèle immunocompétent, souris génétiquement modifiée de cancer colorectal a été développé qui développe des tumeurs hautement uniformes et peut être utilisé pour des études de biologie tumorale ainsi que des essais thérapeutiques. Le développement de la tumeur est déclenché par une infection chirurgicale et segmentaire du côlon distal avec le virus adeno-cre chez les souris mutantes conditionnelles composées. Les tumeurs peuvent être facilement détectées et surveillées par coloscopie. Nous décrivons ici la technique chirurgicale de l'infection adénoculaire segmentaire deLe colon, la surveillance de la tumeur par coloscopie à haute résolution et présente les tumeurs colorectales résultantes.
Introduction
Le cancer colorectal (CRC) continue d'être l'une des principales causes de mortalité liée au cancer dans les pays occidentaux. 1 Alors que le pronostic des patients atteints d'une maladie de stade précoce est bon, de nombreuses tumeurs sont diagnostiquées à des stades ultérieurs où, malgré de nombreuses options de traitement, le pronostic est limité. 2 , 3 , 4 , 5
La majorité des modèles actuels de souris de CRC sont basés sur l'implantation de cellules tumorales dérivées de lignées cellulaires ou de tumeurs patientes en souris immunodéficientes. 6 , 7 , 8 Cela conduit à la localisation et, selon le site d'injection et les cellules tumorales utilisées pour l'injection, parfois des tumeurs métastatiques. 9 , 10 Cependant, les modèles de xénogreffe résultants ont majoR limitations. Ils doivent être établis chez des souris immunodéficientes, éliminant ainsi l'interaction complexe entre la tumeur et le système immunitaire de l'hôte. De plus, comme le stroma tumoral est dérivé de cellules hôtes, l'interaction entre le parenchyme tumoral humain et le stroma murin est défectueuse et n'est donc pas représentative de la maladie. Ces lacunes peuvent être évitées par l'utilisation de lignées cellulaires murines pour injection. Cependant, seules quelques lignes de cellules CRC murines sont disponibles et, semblables à la plupart des lignées de cellules CRC humaines disponibles, sont monoclonales et hautement anaplasiques. 11 En résumé, la plupart des modèles de souris CRC actuellement disponibles sont hautement artificiels et ne sont pas entièrement représentatifs de la maladie humaine.
Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) de CRC peuvent éviter ces inconvénients car ils présentent des tumeurs de souris authentiques qui sont créées par l'induction de mutations clés de CRC dans le côlon. 12 , 13 ,14 Ceci peut être réalisé par l'activation de mutations de la lignée germinale conditionnelle (floxed) par la recombinase cré dans la muqueuse colorectale. Alors que dans les GEMM de nombreuses autres entités tumorales, l'expression de la lignée germinale (inducible) conduite par des promoteurs spécifiques de tissu est utilisée, la lignée germique ne peut pas être utilisée dans le côlon car cela conduit à un grand nombre d'adénomes dans tout le colon provoquant la mort par une charge tumorale bénigne à Un très jeune âge. Par conséquent, dans le modèle décrit ici, un creuset exprimant un vecteur adénoviral est utilisé pour infecter un court segment de côlon. Cela conduit à l'induction de la tumorigénèse dans ce segment de la muqueuse à un moment défini par l'investigateur, ce qui entraîne des adénomes qui progressent finalement vers un carcinome invasif et métastatique. Les tumeurs sont des tumeurs de souris authentiques, poussent dans un micro-environnement intact et sont donc capables de simuler l'intégrité de l'oncogenèse colorectale, y compris l'interaction tumeur-hôte et la cascade métastatique. Ce modèle estDonc une plate-forme attrayante pour les études sur la biologie du cancer et les essais thérapeutiques précliniques.
Un inconvénient majeur des modèles de souris génétiquement modifiés de CRC est leur complexité technique. La délivrance de la création locale à l'aide d'enemas rectangulaires adeno-cre chez des souris portant des allèles Apc floxed a été décrite précédemment; Cependant, l'incidence, la multiplicité et l'emplacement des tumeurs intestinales peuvent être très variables avec cette technique. 15 Par conséquent, la technique de confinement de l'infection adéno-creuse par serrage chirurgical du segment à induire a été développée. 13 Nous avons modifié cette procédure afin d'améliorer le bien-être des animaux, ainsi que de réduire la mortalité et le nombre de tumeurs qui en résultent. Avec ce protocole, tous les laboratoires ayant une expérience en chirurgie de petits rongeurs devraient pouvoir reproduire le modèle et produire des tumeurs hautement reproductibles et facilement accessibles à la coloscopie. Selon le m conditionnelLes utilisations utilisées pour la tumorigénèse, le spectre complet de l'adénome, du carcinome invasif et des métastases peuvent être observés. Comme les tumeurs sont situées dans le côlon distal, l'évaluation endoscopique en série est facilement possible dans ce modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien qu'ils soient généralement faciles à générer et à maintenir, les modèles de souris CRC classiques basés sur l'injection de ligne cellulaire sont artificiels et ne sont pas en mesure de récapituler complètement la maladie humaine. En conséquence, les GEMM ont été développés. Le premier CRC GEMM était la souris Apc Min , qui abrite une mutation hétérozygote null dans le gène Apc, imitant ainsi la polypose adénomateuse familiale (FAP) de la maladie héréditaire humaine. <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est consacré à la mémoire du professeur Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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