פרוטוקול להקמת מודל עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס על ידי זיהום adeno-cre קטע ו מעקב שלה באמצעות קולונוסקופיה ברזולוציה גבוהה מוצג.
למרות היתרונות של תחולת קל ויעילות עלות, מודלים של סרטן המעי הגס המעי הגס המבוססים על הזרקת תאים סרטניים יש מגבלות חמורות ולא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר מהונדסים גנטית הוכנסו כדי להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים כאלה דורשים מבחינה טכנית, במיוחד באיברים גדולים כגון המעי הגס שבו רק גידול אחד הוא הרצוי.
כתוצאה מכך, פותח מודל עכבר מהונדס גנטית, מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס, אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. פיתוח הגידול הוא יזמה על ידי זיהום כירורגי, מקטעי של המעי הגס דיסטלי עם וירוס adeno-cre בעכברים מוטציה מותנה מותנה. גידולים ניתן לזהות בקלות ובקרה באמצעות קולונוסקופיה. אנו מתארים כאן את הטכניקה הכירורגית של זיהום אדגנו-קריטיאת המעי הגס, את מעקב אחר הגידול באמצעות קולונוסקופיה ברזולוציה גבוהה ולהציג את גידולים המעי הגס וכתוצאה מכך.
סרטן המעי הגס (CRC) ממשיך להיות אחד הגורמים המובילים למוות הקשור לסרטן במדינות המערב. 1 בעוד שהפרוגנוזה של מטופלים בשלב מוקדם של המחלה טובה, גידולים רבים מאובחנים בשלבים מאוחרים יותר, שלמרות אפשרויות הטיפול הרבות, הפרוגנוזה מוגבלת. 2 , 3 , 4 , 5
רוב המודלים עכבר הנוכחי של CRC מבוססים על ההשתלה של תאים סרטניים נגזר שורות תאים או גידולים החולה לעכברים immunodeficient. 6 , 7 , 8 זה מוביל המקומי, בהתאם לאתר ההזרקה ואת תאים סרטניים המשמשים להזרקת, לפעמים גידולים גרורתי. 9 , 10 עם זאת, מודלים xenograft וכתוצאה מכך יש majoR מגבלות. הם חייבים להיות הוקמה בעכברים immunodeficient, ובכך לחסל את האינטראקציה המורכבת בין הגידול לבין המערכת החיסונית המארחת. בנוסף, כמו stroma הגידול נגזר תאים המארח, האינטראקציה בין parenchyma הגידול האנושי stroma הגידול הוא פגום ולכן לא נציג של המחלה. ליקויים אלה ניתן להימנע על ידי שימוש שורות תאים Murine עבור הזרקת. עם זאת, רק כמה תאים Murine תא CRC זמינים, בדומה לקווים התא האנושי CRC ביותר זמינים, הם חד שבטיים ו anaplastic. 11 לסיכום, רוב הדגמים עכבר CRC זמין כיום הם מלאכותיים מאוד ולא נציג מלא של המחלה האנושית.
מודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMM) של CRC יכולים למנוע את החסרונות הללו כאשר הם מכילים גידולי עכבר אמיתיים אשר נוצרים באמצעות אינדוקציה של מוטציות מפתח של CRC במעי הגס. 12 , 13 ,14 זה יכול להיות מושגת על ידי הפעלת מוטציות גרמלין מותנה (floxed) germline ידי recombinase cre בתוך רירית המעי הגס. בעוד GEMMs של גופים רבים אחרים של הגידול germline (inducible) ביטוי ביטוי מונע על ידי מקדמי רקמה ספציפי משמש, germline cre לא ניתן להשתמש במעי הגס כמו זה מוביל למספר רב של אדנומות ברחבי המעי הגס גרימת מוות על ידי עומס הגידול שפיר ב גיל צעיר מאוד. לכן, במודל המתואר כאן וקטור adenoviral להביע Cre משמש להדביק קטע המעי הגס קצר. זה מוביל את אינדוקציה של tumorigenesis בתוך קטע זה של רירית בנקודת זמן שהוגדר על ידי החוקר, וכתוצאה מכך אדנומות בסופו של דבר מתקדמים קרצינומה פולשנית וגרורות. הגידולים הם גידולים אמיתיים של העכבר, לגדול microenvironment שלם ולכן הם מסוגלים לדמות את מכלול של oncogenesis המעי הגס כולל אינטראקציה המארח הגידול ואת מפל גרורתי. מודל זה הואולכן פלטפורמה אטרקטיבית למחקרים על ביולוגיה של סרטן ומחקרים פרה-קליניים.
החסרון העיקרי של מודלים עכבר מהונדסים גנטית של CRC הוא המורכבות הטכנית שלהם. לידה מקומית באמצעות חוקנים אדקטו-קיציים בעכברים שנשאו אללים של Apc מתפוררים תוארה בעבר; עם זאת, שכיחות, ריבוי ומיקום של גידולים המעי יכול להיות משתנה מאוד עם טכניקה זו. 15 לכן, הטכניקה של הגבלת זיהום adeno-cre ידי הידוק כירורגית של קטע להיות המושרה פותחה. 13 שינינו את הנוהל הזה כדי לשפר את רווחת בעלי החיים, כמו גם להפחית את התמותה ואת מספר הגידולים שהתקבלו. עם פרוטוקול זה, כל המעבדות עם ניסיון ניתוח מכרסמים קטנים צריכים להיות מסוגלים לשכפל את המודל לייצר גידולים אשר לשחזור מאוד נגיש בקלות קולונוסקופיה. בהתאם מ מותנהUtations המשמשים tumorigenesis, הספקטרום המלא של אדנומה, קרצינומה פולשנית וגרורות ניתן לראות. כמו גידולים ממוקמים המעי הגס דיסטלי, הערכה אנדוסקופית טורית הוא אפשרי בקלות במודל זה.
בעוד הם בדרך כלל קל ליצור ולתחזק, מודלים קלאסיים עכבר CRC מבוסס על הזרקת קו התא הם מלאכותיים ולא מסוגלים לשחזר באופן מלא את המחלה האנושית. כתוצאה מכך, GEMMs פותחו. ה- CRC GEMM הראשון היה עכבר ה- Apc Min , המוטבע במוטציה מוטורית הטרוזיגוטית בגן ה- Apc, ולכן מחקה את המחלה ההומאנית…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מוקדשת לזכרו של פרופ 'מוריץ קוך.
Reagents / consumables | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analgesia / anesthesia | |||
Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Colonoscopy | |||
Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |