Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico
Summary
Viene presentato un protocollo per la creazione di un modello di topi geneticamente modificato del cancro del colon-retto mediante infezione adenocarica segmentale e la sua sorveglianza mediante colonscopia ad alta risoluzione.
Abstract
Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo tumorale colorato a base di iniezione di cellule tumorali hanno gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli del mouse geneticamente modificati sono stati introdotti per superare questi limiti; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente in grandi organi come il colon in cui è desiderato un solo tumore.
Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di topo immunocompetente, geneticamente modificato del cancro del colon-retto, che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale, nonché studi terapeutici. Lo sviluppo del tumore è iniziato dall'infezione chirurgica, segmentale del colon distale con virus adeno-cre in topi condizionati condizionatamente mutanti. I tumori possono essere facilmente rilevati e monitorati tramite colonscopia. Qui descriviamo la tecnica chirurgica dell'infezione segmentale di adeno-creIl colon, la sorveglianza del tumore mediante colonscopia ad alta risoluzione e presentare i tumori colorettali risultanti.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) continua ad essere una delle cause principali della morte correlata ai tumori nei paesi occidentali. 1 Mentre la prognosi dei pazienti con malattia precoce è buona, molti tumori vengono diagnosticati in fasi successive in cui, nonostante numerose opzioni di trattamento, la prognosi è limitata. 2 , 3 , 4 , 5
La maggior parte dei modelli di mouse correnti del CRC si basa sull'impianto di cellule tumorali derivate da linee cellulari o tumori del paziente in topi immunodeficienti. 6 , 7 , 8 Questo porta a locali e, a seconda del sito di iniezione e delle cellule tumorali utilizzate per l'iniezione, a volte tumori metastatici. 9 , 10 Tuttavia, i modelli risultanti di xenograft hanno majoR limitazioni. Devono essere stabiliti in topi immunodeficienti, eliminando così l'interazione complessa tra il tumore e il sistema immunitario ospitante. Inoltre, poiché lo stroma tumorale è derivato da cellule ospitanti, l'interazione tra parenchima tumorale umana e stroma murina è difettosa e quindi non rappresentativa della malattia. Queste carenze possono essere evitate con l'uso di linee cellulari murine per l'iniezione. Tuttavia, solo alcune linee di cellule CRC murine sono disponibili e, simili alla maggior parte delle linee cellulari CRC umane disponibili, sono monoclonali e altamente anaplatiche. 11 In sintesi, la maggior parte dei modelli CRC attualmente disponibili sono altamente artificiali e non rappresentano pienamente rappresentativi della malattia umana.
I modelli di topi geneticamente modificati (GEMM) di CRC possono evitare questi inconvenienti in quanto presentano tumori di mouse genuini che vengono creati attraverso l'induzione di mutazioni chiave del CRC nel colon. 12 , 13 ,14 Ciò può essere ottenuto mediante l'attivazione di mutazioni della germinazione condizionale (floxed) mediante la ricombinasi all'interno della mucosa colorettale. Mentre in GEMM di molte altre entità del tumore si utilizza l'espressione germinale (inducibile) creata da promotori specifici del tessuto, la creazione di germline cre non può essere utilizzata nel colon come questo porta ad un gran numero di adenomi in tutto il colon causando la morte per carico tumorale benigno Un'età molto giovane. Pertanto, nel modello qui descritto, un virus adenovirale che esprime l'espressione cre è usato per infettare un segmento corto di due punti. Ciò porta all'induzione della tumorigenesi all'interno di questo segmento della mucosa in un punto temporale definito dall'individuo, con conseguente adenoma in ultima analisi che procede al carcinoma invasivo e metastatico. I tumori sono tumori genuini del topo, crescono in un microambiente intatto e quindi sono in grado di simulare l'intero oncogenesis del colon-retto, tra cui l'interazione tumor-host e la cascata metastatica. Questo modello èQuindi una piattaforma interessante per studi sulla biologia del cancro e sulle prove terapeutiche precliniche.
Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi geneticamente modificati del CRC è la loro complessità tecnica. La distribuzione locale cre crea con clistere rettale adeno-cre nei topi che trasportano alleli APc floccati è stata descritta prima; Tuttavia, l'incidenza, la molteplicità e l'ubicazione dei tumori intestinali possono essere molto variabili con questa tecnica. Pertanto, è stata sviluppata la tecnica di limitare l'infezione da adeno-cre mediante bloccaggio chirurgico del segmento da indurre. 13 Abbiamo modificato questa procedura per migliorare il benessere degli animali, ridurre la mortalità e il numero di tumori che ne derivano. Con questo protocollo, tutti i laboratori con esperienza in piccole chirurgia di roditori dovrebbero poter riprodurre il modello e produrre tumori altamente riproducibili e facilmente accessibili alla colonscopia. A seconda del condizionale mSi possono osservare utature utilizzate per tumorigenesi, l'intero spettro di adenoma, carcinoma invasivo e metastasi. Poiché i tumori si trovano nel colon distale, la valutazione endoscopica seriale è facilmente possibile in questo modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre sono generalmente facili da generare e mantenere, i modelli classici di CRC basati sull'iniezione della linea cellulare sono artificiali e non sono in grado di ricapitolare completamente la malattia umana. Di conseguenza, i GEMM sono stati sviluppati. Il primo GEMM CRC era il mouse Apc Min , che ospita una mutazione null eterozigote nel gene Apc, quindi imitando la poliposi adenomatica familiare familiare (FAP) della malattia ereditaria umana. Tuttavia, i topi Apc Min sviluppano invariab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è dedicato alla memoria del professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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