산발성 대장 암의 유 전적으로 조작 된 마우스 모델
Summary
분절성 아데노 크리 (adeno-cre) 감염 및 고해상도 대장 내시경 검사 를 통한 대장 암의 유 전적으로 조작 된 마우스 모델을 확립하기위한 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
쉽게 적용 할 수 있고 비용 효과가 있다는 장점에도 불구하고, 종양 세포 주입에 근거한 대장 암 마우스 모델은 심각한 한계가 있으며 종양 생물학 및 종양 세포 보급을 정확하게 시뮬레이트하지 못합니다. 이러한 제한을 극복하기 위해 유전 공학 마우스 모델이 도입되었습니다. 그러나 이러한 모델은 기술적으로 까다 롭습니다. 특히 단일 종양 만 원하는 결장과 같은 대형 장기에서 특히 그렇습니다.
결과적으로 고도로 균일 한 종양을 발달시키고 종양 생물학 연구 및 치료 임상 시험에 사용할 수있는 면역 능력이있는 유전자 조작 마우스 결장 직장암 모델이 개발되었습니다. 종양 발달은 화합물 조건부 돌연변이 마우스에서 아데노 크립 바이러스로 원위 결장의 외과 적, 분절성 감염에 의해 개시된다. 종양은 대장 내시경 검사를 통해 쉽게 감지하고 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기에 대한 세그먼트 adeno – cre 감염의 수술 기법을 설명콜론, 고해상도 대장 내시경 검사 를 통한 종양 감시 및 결과 대장 암 종양 존재.
Introduction
대장 암 (CRC)은 서구 국가에서 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 1 초기 병기의 환자의 예후가 양호한 반면 많은 치료 옵션에도 불구하고 많은 예후가 제한되는 후기 단계에서 많은 종양이 진단됩니다. 2 , 3 , 4 , 5
CRC의 현재 마우스 모델의 대다수는 세포주 또는 환자 종양에서 유래 된 종양 세포를 면역 결핍 마우스에 이식하는 것을 기본으로합니다. 6 , 7 , 8 이것은 주사 부위와 주사에 사용 된 종양 세포, 때로는 전이성 종양에 따라 국부적으로 이어집니다. 9 , 10 그러나 이종 이식 모델은 major 제한. 그들은 면역 결핍 마우스에서 확립되어야하며 따라서 종양과 숙주 면역계 사이의 복잡한 상호 작용을 제거해야합니다. 또한, 종양 기질은 숙주 세포로부터 유래되기 때문에, 인간 종양 실질과 마우스 기질 사이의 상호 작용은 결함이있어 질병을 대표하지 못한다. 이러한 결핍은 마우스 세포주를 주입하여 피할 수 있습니다. 그러나, 단지 몇 가지 쥐 CRC 세포주가 이용 가능하며, 대부분의 이용 가능한 인간 CRC 세포주와 유사하게 단일 클론 성 및 고도 변성가이다. 요약하면, 현재 이용 가능한 대부분의 CRC 마우스 모델은 인위적인 질병을 완전히 대표하지 않는 매우 인공적이다.
CRC의 유전 공학 마우스 모델 (GEMM)은 대장에서 CRC의 주요 돌연변이 유발을 통해 생성되는 진정한 마우스 종양을 특징으로하기 때문에 이러한 단점을 피할 수 있습니다. 12 , 13 ,이것은 결장 직장 점막에서 cre recombinase에 의한 조건 적 (floxed) germline 돌연변이의 활성화에 의해 달성 될 수있다. 많은 다른 종양 엔티티의 GEMM에서 조직 특이 적 프로모터에 의해 유도 된 생식선 (유도 성) cre 발현이 사용되는 경우, 결장 내에서 양성 종양 부하에 의한 사망을 유발하는 다수의 선종이 생기기 때문에 생식선 크립을 결장에 사용할 수 없다. 아주 어린 나이. 따라서, 여기에 기술 된 모델에서, cre를 발현하는 아데노 바이러스 벡터는 짧은 콜론 절편을 감염 시키는데 사용된다. 이것은 조사자에 의해 정의 된 시점에서 점막의이 부분 내에서 종양 형성을 유도하여 결국 선종이 침윤성 및 전이성 암종으로 진행되게한다. 종양은 순수한 마우스 종양으로 손상되지 않은 미세 환경에서 자라며 종양 – 숙주 상호 작용과 전이성 캐스케이드를 포함한 대장 암 종양 발생의 전체를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 이 모델은따라서 암 생물학 및 전임상 치료 시험 연구를위한 매력적인 플랫폼입니다.
유 전적으로 조작 된 마우스 모델의 주요한 단점은 기술적 인 복잡성이다. floxed Apc 대립 유전자를 가진 생쥐에서 직장 아데노 크리 (recten adeno-cre) 관장을 이용한 국소 크립 전달은 이전에 기술되어있다. 그러나이 기술을 사용하면 장 종양의 발생률, 다양성 및 위치가 매우 다양 할 수 있습니다. 따라서 유도되는 부분의 외과 클램핑에 의한 아데노 크리 감염을 제한하는 기술이 개발되었다. 우리는 동물 복지를 개선하고 사망률과 결과 종양의 수를 줄이기 위해이 절차를 수정했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 작은 설치류 수술 경험이있는 모든 실험실에서 모델을 재현하고 대장 내시경 검사에 쉽게 액세스 할 수있는 종양을 생산할 수 있어야합니다. 조건부 m에 따라종양 형성에 사용되는 발작, 선종의 전체 스펙트럼, 침윤성 암종 및 전이가 관찰 될 수있다. 종양이 대장 결장에 위치하므로이 모델에서 일련의 내시경 검사가 쉽게 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로 생성 및 유지가 쉽지만, 세포주 주입에 기반한 고전적인 CRC 마우스 모델은 인위적이며 인간 질병을 완전히 되풀이 할 수 없습니다. 결과적으로 GEMM이 개발되었습니다. 첫 번째 CRC GEMM은 Apc 유전자의 이형 변이 돌연변이를 가지고있는 Apc Min 마우스 였고, 따라서 인간 유전병 인 가족 성 대장 용종증 (FAP)을 모방했다. 그러나 Apc Min 마우스는 콜론에 국한되지 않는 다발성 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Moritz Koch 교수의 기억에 전념합니다.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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