Um modelo de mouse de engenharia genética de câncer colorretal esporádico
Summary
É apresentado um protocolo para o estabelecimento de um modelo de ratinho geneticamente modificado de câncer colorretal por infecção segmentar adeno-cre e sua vigilância através de colonoscopia de alta resolução.
Abstract
Apesar das vantagens da aplicabilidade e da relação custo-eficácia, os modelos de ratos de câncer colorretal baseados na injeção de células tumorais apresentam limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse geneticamente modificados foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos grandes, como o cólon, no qual apenas um único tumor é desejado.
Como resultado, desenvolveu-se um modelo de câncer colorretal imunocompetente, geneticamente modificado, que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. O desenvolvimento de tumores é iniciado por infecção cirúrgica segmentar do cólon distal com vírus adeno-cri em murganhos condicionalmente mutantes compostos. Os tumores podem ser facilmente detectados e monitorados via colonoscopia. Aqui descrevemos a técnica cirúrgica da infecção segmentar de adeno-creO cólon, a vigilância do tumor através de colonoscopia de alta resolução e apresentar os tumores colorretais resultantes.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) continua a ser uma das principais causas de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. 1 Embora o prognóstico de pacientes com doença em estágio inicial seja bom, muitos tumores são diagnosticados em estágios posteriores em que, apesar das numerosas opções de tratamento, o prognóstico é limitado. 2 , 3 , 4 , 5
A maioria dos modelos de ratos atuais de CRC baseia-se na implantação de células tumorais derivadas de linhas celulares ou tumores de pacientes em camundongos imunodeficientes. 6 , 7 , 8 Isso leva ao local e, dependendo do local da injeção e das células tumorais usadas para injeção, às vezes tumores metastáticos. 9 , 10 No entanto, os modelos de xenoenxerto resultantes têm majoLimitações. Eles devem ser estabelecidos em camundongos imunodeficientes, eliminando assim a interação complexa entre o tumor e o sistema imune do hospedeiro. Além disso, como o estroma do tumor é derivado de células hospedeiras, a interação entre o parênquima do tumor humano eo estroma murino é defeituosa e, portanto, não é representativa da doença. Essas deficiências podem ser evitadas pelo uso de linhas celulares murinas para injeção. No entanto, apenas algumas linhas celulares CRC murinas estão disponíveis e, semelhantes às linhas celulares humanas de CRC, são monoclonais e altamente anaplásticas. 11 Em resumo, a maioria dos modelos de ratos CRC actualmente disponíveis são altamente artificiais e não são totalmente representativos da doença humana.
Os modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) do CRC podem evitar essas desvantagens, pois apresentam tumores de mouse genuínos que são criados através da indução de mutações-chave do CRC no cólon. 12 , 13 ,14 Isso pode ser conseguido pela ativação de mutações germinais condicionais (floxed) pela recombinase cre dentro da mucosa colorretal. Enquanto em GEMMs de muitas outras entidades tumorais, a expressão de cremes germinativas (indutíveis) conduzida por promotores específicos de tecidos é usada, o credo germinal não pode ser usado no cólon, pois isso leva a um grande número de adenomas em todo o cólon causando a morte por carga tumoral benigna em Uma idade muito jovem. Portanto, no modelo descrito aqui, um credo que expressa o vetor adenoviral é usado para infectar um curto segmento do cólon. Isso leva à indução de tumorigênese dentro deste segmento da mucosa em um ponto de tempo definido pelo investigador, resultando em adenomas em última instância, progredindo em carcinoma invasivo e metastático. Os tumores são tumores de ratos genuínos, crescem em um microambiente intacto e, portanto, são capazes de simular a totalidade da oncogênese colorretal, incluindo a interação tumor-hospedeiro e a cascata metastática. Este modelo éPortanto, uma plataforma atraente para estudos de biologia do câncer e ensaios terapêuticos pré-clínicos.
Uma grande desvantagem dos modelos de mouse geneticamente modificados da CRC é a sua complexidade técnica. A entrega de crema local usando enemas de adeno-creativo rectal em camundongos com alelos de Apc floxed foi descrita anteriormente; No entanto, a incidência, a multiplicidade ea localização dos tumores intestinais podem ser altamente variáveis com esta técnica. 15 Portanto, a técnica de confinamento da infecção adeno-creativa pelo aperto cirúrgico do segmento a induzir foi desenvolvida. 13 Alteramos este procedimento para melhorar o bem-estar dos animais, bem como reduzir a mortalidade e o número de tumores resultantes. Com este protocolo, todos os laboratórios com experiência em cirurgia de roedores pequenos devem poder reproduzir o modelo e produzir tumores altamente reprodutíveis e de fácil acesso à colonoscopia. Dependendo do condicional mUsos utilizados para a tumorigênese, o espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo e metástases podem ser observados. À medida que os tumores estão localizados no cólon distal, a avaliação endoscópica em série é facilmente possível neste modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora geralmente sejam fáceis de gerar e manter, os modelos clássicos de ratos CRC baseados na injeção de linha celular são artificiais e não são capazes de recapitular completamente a doença humana. Como conseqüência, os GEMMs foram desenvolvidos. O primeiro CRC GEMM foi o mouse Apc Min , que abriga uma mutação nula heterozigótica no gene Apc, imitando a polipose adenomatosa familiar (FAP) da doença hereditária humana. 21 Contudo, os ratos Apc Min invariavel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é dedicado à memória do professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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