Un modelo de ratón de ingeniería genética de cáncer colorrectal esporádico
Summary
Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo genético de ratón de cáncer colorrectal por infección segmentaria de adenovirus y su vigilancia mediante colonoscopia de alta resolución.
Abstract
A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratones de cáncer colorrectal basados en la inyección de células tumorales tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratón genéticamente modificados para superar estas limitaciones; Sin embargo, tales modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos grandes como el colon en el que sólo se desea un solo tumor.
Como resultado, se desarrolló un modelo inmunocompetente, modificado genéticamente, de cáncer colorrectal que desarrolla tumores muy uniformes y puede usarse para estudios de biología tumoral así como para ensayos terapéuticos. El desarrollo tumoral se inicia mediante la infección quirúrgica segmentaria del colon distal con el virus adeno-cre en ratones mutantes condicionalmente compuestos. Los tumores pueden ser fácilmente detectados y monitorizados vía colonoscopia. Aquí describimos la técnica quirúrgica de la infección segmentaria adeno-cre deEl colon, la vigilancia del tumor vía colonoscopia de alta resolución y presentan los tumores colorrectales resultantes.
Introduction
El cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. 1 Aunque el pronóstico de los pacientes con enfermedad en estadio temprano es bueno, muchos tumores son diagnosticados en etapas posteriores en los que, a pesar de las numerosas opciones de tratamiento, el pronóstico es limitado. 2 , 3 , 4 , 5
La mayoría de los actuales modelos de CRC de ratones se basan en la implantación de células tumorales derivadas de líneas celulares o tumores de pacientes en ratones inmunodeficientes. 6 , 7 , 8 Esto conduce a local y, dependiendo del sitio de inyección y de las células tumorales utilizadas para inyección, a veces tumores metastásicos. 9 , 10 Sin embargo, los modelos de xenoinjerto resultantes tienen majoR limitaciones. Deben establecerse en ratones inmunodeficientes, eliminando así la interacción compleja entre el tumor y el sistema inmune del huésped. Además, como el estroma tumoral se deriva de las células huésped, la interacción entre el parénquima tumoral humano y el estroma murino es defectuosa y por lo tanto no es representativa de la enfermedad. Estas deficiencias pueden evitarse mediante el uso de líneas de células murinas para inyección. Sin embargo, sólo hay pocas líneas de células de CRC murinas disponibles y, similares a la mayoría de las líneas de células CRC humanas disponibles, son monoclonales y altamente anaplásticas. En resumen, la mayoría de los modelos de ratón CRC actualmente disponibles son altamente artificiales y no son totalmente representativos de la enfermedad humana.
Modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) de CRC pueden evitar estos inconvenientes, ya que presentan verdaderos tumores de ratón que se crean a través de la inducción de las principales mutaciones de CRC en el colon. 12 , 13 ,Esto puede lograrse mediante la activación de las mutaciones de la línea germinal condicional (floxed) por cre recombinasa dentro de la mucosa colorrectal. Mientras que en GEMMs de muchas otras entidades tumorales germline (inducible) cre expresión impulsada por promotores específicos de tejidos se utiliza, línea germinal cre no se puede utilizar en el colon, ya que esto conduce a un gran número de adenomas en todo el colon causando la muerte por tumor benigno carga a Una edad muy joven. Por lo tanto, en el modelo descrito aquí se utiliza un vector adenoviral que expresa cre para infectar un segmento de colon corto. Esto conduce a la inducción de la tumorigénesis dentro de este segmento de la mucosa en un punto de tiempo definido por el investigador, dando lugar a adenomas en última instancia, progresando a carcinoma invasivo y metastásico. Los tumores son verdaderos tumores de ratón, crecen en un microambiente intacto y por lo tanto son capaces de simular la totalidad de la oncogénesis colorrectal incluyendo la interacción tumor-huésped y la cascada metastásica. Este modelo esPor lo tanto, una plataforma atractiva para estudios de biología del cáncer y ensayos terapéuticos preclínicos.
Una de las principales desventajas de los modelos de CRC modificados genéticamente es su complejidad técnica. Se ha descrito anteriormente la administración local de crema usando enemas de adeno-crema rectales en ratones que llevan alelos de Apc floxed; Sin embargo, la incidencia, multiplicidad y localización de los tumores intestinales puede ser altamente variable con esta técnica. Por lo tanto, se ha desarrollado la técnica de confinar la infección adeno-cre por pinzamiento quirúrgico del segmento a inducir. 13 Hemos modificado este procedimiento con el fin de mejorar el bienestar animal, así como reducir la mortalidad y el número de tumores resultantes. Con este protocolo, todos los laboratorios con experiencia en cirugía de roedores pequeños deben ser capaces de reproducir el modelo y producir tumores que sean altamente reproducibles y de fácil acceso a la colonoscopia. Dependiendo del condicional mUvas utilizadas para la tumorigénesis, se puede observar el espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo y metástasis. Como los tumores se localizan en el colon distal, la evaluación endoscópica seriada es fácilmente posible en este modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que son generalmente fáciles de generar y de mantener, los modelos clásicos del ratón del CRC basados en la inyección de la línea celular son artificiales y no pueden recapitulate completamente la enfermedad humana. Como consecuencia, se han desarrollado GEMMs. El primer CRC GEMM fue el ratón Apc Min , que alberga una mutación nula heterocigótica en el gen Apc, por lo tanto imitando la enfermedad hereditaria humana poliposis adenomatosa familiar (FAP). Sin embargo, los ratones Apc …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está dedicado a la memoria del profesor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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