En genetiskt konstruerad musmodell av sporadisk kolorektal cancer
Summary
Ett protokoll för upprättandet av en genmodifierad musmodell av kolorektal cancer genom segmentad adeno-cre-infektion och dess övervakning via kolonoskopi med hög upplösning presenteras.
Abstract
Trots fördelarna med enkel användbarhet och kostnadseffektivitet har muskelmodeller med kolorektal cancer baserat på tumörcellinsprutning svåra begränsningar och simulerar inte noggrant tumörbiologi och tumörcellspridning. Genetiskt konstruerade musmodeller har införts för att övervinna dessa begränsningar; Emellertid är sådana modeller tekniskt krävande, speciellt i stora organ, såsom kolon, i vilket endast en enda tumör önskas.
Som ett resultat av detta utvecklades en immunokompetent, genetiskt konstruerad musmodell av kolorektal cancer som utvecklar starkt likformiga tumörer och kan användas för tumörbiologiska studier såväl som terapeutiska försök. Tumörutveckling initieras genom kirurgisk, segmentinfektion i distal kolon med adeno-cre-virus i kompositionen villkorligt mutanta möss. Tumörerna kan lätt detekteras och övervakas via koloskopi. Här beskrivs kirurgisk teknik för segmentad adeno-cre-infektion avKolon, övervakning av tumören via kolonoskopi med hög upplösning och uppvisande de resulterande kolorektala tumörerna.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) fortsätter att vara en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad död i västra länder. 1 Även om prognosen hos patienter med tidig sjukdom är bra, diagnostiseras många tumörer vid senare skeden, där prognosen är begränsad trots många behandlingsalternativ. 2 , 3 , 4 , 5
Majoriteten av nuvarande musmodeller av CRC är baserade på implantering av tumörceller härledda från cellinjer eller patienttumörer till immundeficenta möss. 6 , 7 , 8 Detta leder till lokala och, beroende på injektionsstället och de tumörceller som används för injektion, ibland metastatiska tumörer. 9 , 10 De resulterande xenograftmodellerna har emellertid majoR begränsningar. De måste etableras i immunbristande möss, vilket eliminerar den komplexa interaktionen mellan tumören och värdimmunsystemet. Eftersom tumörstromen härleds från värdceller är dessutom interaktionen mellan humant tumörparenkym och murin stroma defekt och därför inte representativ för sjukdomen. Dessa brister kan undvikas genom användning av murincellinjer för injektion. Emellertid är endast få murina CRC-cellinjer tillgängliga och, liknande de flesta tillgängliga humana CRC-cellinjer, är monoklonala och mycket anaplastiska. 11 Sammanfattningsvis är de flesta tillgängliga CRC-musmodellerna mycket artificiella och inte fullständigt representativa för den mänskliga sjukdomen.
Genetiskt manipulerade musmodeller (GEMM) hos CRC kan undvika dessa nackdelar, eftersom de uppvisar äkta mustumörer som skapas via induktion av nyckelmutationer av CRC i kolon. 12 , 13 ,14 Detta kan åstadkommas genom aktivering av betingade (floxed) kimlinjemutationer genom cre rekombinas inom kolorektal slemhinna. Medan i GEMM från många andra tumörenheter används germline (inducerbart) cre-uttryck som drivs av vävnadsspecifika promotorer, kan germline cre inte användas i tjocktarmen, eftersom detta leder till ett stort antal adenomer i hela tjocktarmen som orsakar död genom godartad tumörbelastning vid En mycket ung ålder. Därför används i den här beskrivna modellen en adenoviral vektoruttryckande cre för att infektera ett kort tjocktarmsegment. Detta leder till induktion av tumörgenesen inom detta segment av slemhinnan vid en tidpunkt som definierats av undersökaren, vilket resulterar i adenomer som i slutändan utvecklas till invasivt och metastatiskt karcinom. Tumörerna är äkta mustumörer, växer i en intakt mikromiljö och kan därför simulera helheten av kolorektal onkogenes inklusive tumör-värd-interaktion och metastatisk kaskad. Denna modell ärDärför en attraktiv plattform för studier av cancerbiologi och prekliniska terapeutiska studier.
En stor nackdel med genetiskt modifierade musmodeller av CRC är deras tekniska komplexitet. Lokal cre-leverans med användning av rektala adeno-cre-enemas i möss som bär floxade Apc-alleler har beskrivits tidigare; Emellertid kan incidensen, multipliciteten och placeringen av tarmtumörerna vara mycket variabel med denna teknik. 15 Därför har tekniken att begränsa adeno-cre-infektionen genom kirurgisk klämning av segmentet som skall induceras utvecklats. 13 Vi har ändrat denna procedur för att förbättra djurs välbefinnande, samt minska dödligheten och antalet resulterande tumörer. Med detta protokoll bör alla laboratorier med erfarenhet av liten gnagareoperation kunna reproducera modellen och producera tumörer som är mycket reproducerbara och lättillgängliga för koloskopi. Beroende på den villkorliga mUtationer som används för tumörigenes, hela spektret av adenom, invasivt karcinom och metastaser kan observeras. Eftersom tumörerna ligger i distal kolon, är seriell endoskopisk bedömning lätt möjlig i denna modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan de generellt är lätta att generera och underhålla, är klassiska CRC-musmodeller baserade på cellinjektion artificiella och kan inte fullständigt rekapitulera den mänskliga sjukdomen. Som en konsekvens har GEMMs utvecklats. Den första CRC GEMM var Apc Min- musen, som har en heterozygot null-mutation i Apc-genen, och efterliknar därför den mänskliga ärftliga sjukdomen familial adenomatous polyposis (FAP). 21 Apc Min- möss utvecklar emellertid oundvikligen fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete är tillägnad minnet av professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
