공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Summary

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

엔지니어링 vascularized 조직을 생성 하 고 organoids 역사적으로 도전 하고있다. 여기는 다층 히드로 microfiber 인터레이스는 비 계 생성을 미세 bioprinting에 따라 새로운 방법에 설명 합니다. 부드러운 달성 bioprinting, 복합 bioink 배합 코어 흐름과 칼 흐름에 의해 운반 가교 솔루션에서 돌출을 포함 하는 핵-칼 미세 프린트 헤드 설계 하 고는 bioprinter에 장착. Alginate와 젤라틴 methacryloyl (GelMA)를 혼합 하 여 즉석 이온 가교의 존재를 겪 습 다 당 류 영구 안정화를 달성 하기 위해 GelMA 구성 요소의 보조 photocrosslinking 뒤 divalent 이온을 선택,이 bioprinting 전략을 사용 하 여 microfibrous 비 계를 얻을 수 있었습니다. 중요 한 것은, bioprinted microfiber 안에 캡슐화 된 내 피 세포는 16 일 문화에 걸쳐 있는 맥 관 구조를 닮은 루멘-같은 구조를 형성할 수 있습니다. Endothelialized microfibrous 비 계는 microfiber의 틈새 공간으로 보조 셀 형식의 후속 시드 통해 vascularized 조직을 구성 하 혈관 침대 추가 사용할 수 있습니다. 미세 bioprinting vascularized 조직에 높은 충실도의 편리한 공학 일반화 된 전략을 제공합니다.

Introduction

조직 공학 목표 생성 기능 조직 대체 대체, 복원, 또는 그 부상 또는 질병 인체^1,2,3,4, 종종 원하는 세포 유형, 생리 활성 분자^5,6및 생체 재료^7,8,,910의 결합을 통해 증대 하는 데 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 조직 공학 기술은도 점점 채택 되었습니다 모델을 생성 하 체 외에 조직과 기관 그들의 비보에 대응, 기존의 지나치게 간소화 평면 셀 문화^{11,12,13,14,15,,1617,18,19}의 대체 약물 개발 등 응용 프로그램의 중요 한 기능을 모방 하는. 두 경우에는 복잡 한 마이크로 아키텍처와 인간의 조직의 계층 구조를 정리 하는 능력은 설계 조직¹⁰의 기능 활성화에 중요 한 되며 특히, 설계 조직으로 혈관 네트워크를 통합 하는 방법을 수요의 vascularization 필드^20,21,,2223가장 큰 과제 중 하나 선물 때문.

날짜 하려면, 다양 한 접근법이 점에서 성공⁸의 다양 한 학위와 설계 조직 구조에 혈관 구조를 구축 하기 위해에서 개발 되었습니다. 예를 들어 자기 집합 내 피 세포의 수 microvascular 네트워크²⁴;의 세대에 대 한 신생 성장 인자 전달 유도 지속적인된 neovascularization^25,26; 혈관 조상 세포의 사용 및 pericytes 용이 내 피 세포 성장 및 어셈블리^24,27; vascularization^28,29;의 정확한 조음을 가능 하 게 설계 비 계 속성 그리고 셀 시트 기술은 혈관 레이어 링³⁰의 편리한 조작을 위해. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략의 맥 관 구조, 자주는 설계 조직 구조 및 따라서 제한 된 재현성 내 혈관의 무작위 배포로 이어지는 공간 패턴을 제어 하는 능력을 부여 하지 않습니다. 지난 몇 년 동안 bioprinting는 이러한 도전, 높은 충실도 및 재현성에 복잡 한 조직 패턴 자동 또는 반자동 방식으로^31,,3233입금의 그들의 비교할 수 없는 다양성으로 인해 솔루션으로 기술 사용의 클래스로 떠오르고 있다. 희생 bioprinting^{34,35,36,,3738}, 포함된 bioprinting^39,,4041, 그리고 속이 빈 구조 bioprinting/biofabrication^{42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,,5253} 는 모든 혈관 또는 vascularized 조직 생성의 가능성을 보여주었다.

또는, microfibrous 건설 기계를 조작 하는 미세 bioprinting 전략 최근 개발 되었습니다, 그리고 alginate 하이브리드 bioink 구성 및 젤라틴 methacryloyl (GelMA) 동심 프린트 헤드 및 염화 칼슘 (CaCl₂) 솔루션의 코어를 통해 전달 된 프린트 헤드^54,55의 외부 칼 집 흐름을 통해 실시 됐다. 후속 photocrosslinking 멀티 레이어 microfibrous 비 계의 영구 안정화를 보장 하는 동안 마이크로 화이버 형성 있도록 alginate 구성 요소의 즉각적인 물리적 가교에 대 한 허용 하는 두 흐름의 공동 압출. 노트, bioprinted microfiber를 캡슐화 하는 내 피 세포 증식 및 유사 관 침대^54,55루멘-같은 구조를 가정 하는 microfiber의 peripheries 향해 마이그레이션을 발견 했다. 이러한 bioprinted endothelialized 혈관 침대 수 이후에 채울 수 원하는 추가 구성 vascularized 조직⁵⁵보조 세포 유형. 이 프로토콜은 따라서 같은 미세 bioprinting 전략 vascularized 조직의 조직 공학 및 organoid 모델링에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 편리한 제조 보장 동심 노즐 설계로 사용의 상세한 절차를 제공 합니다.

Protocol

이 프로토콜에 사용 되는 신생아 쥐 cardiomyocytes 잘 설립 절차56 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Brigham와 여자의 병원에 의해 승인에 따라 2 일 된 Sprague-Dawley 쥐에서 분리 했다. 1입니다.는 Bioprinter의 계측 듀얼-레이어, 동심 미세 프린트 헤드; 생성 하 칼 집으로 큰 무딘 바늘 (예를 들어, 18 G, ½ 인치)의 중심으로 핵심으로 (예를 들어, 27 G, 1…

Representative Results

미세 bioprinting 전략 낮은 점도 bioinks54,55를 사용 하 여 microfibrous 장비의 직접 압출 bioprinting 수 있습니다. 같이 그림 2A, 한 비 계 6 × 6 × 6 m m의 크기와3 포함 된 > microfiber의 30 레이어 10 분 이내 bioprinted 수 있습니다. CaCl2 alginate 구성 요소의 즉각적인 이온 가교 과정에서 bioprint…

Discussion

동축 프린트 헤드의 코어와 칼 집에서 교차 결합 시키는 대리인에서 두는 bioink의 동시 전달 수 있도록 성공적인 미세 bioprinting 향한 중요 한 단계를 나타냅니다. 이 프로토콜에서 예제 프린트 헤드 포탄으로 핵심 및 18 G 바늘 27g 바늘을 사용 하 여 만든, 동안 다양 한 조합 바늘의 다른 크기를 사용 하 여 쉽게 확장할 수 있습니다. 그러나, 흐름의 변화에서 결과 각 단계에 전달, 바늘 크기에서 변경 ?…

Materials

Alginic acid sodium salt from brown algae	Sigma-Aldrich	A0682	BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)	Sigma-Aldrich	410896	98%
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10438026	Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001GFP	GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	12430054	High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor