Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Summary

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Abstract

Engineering gevacuoliseerd weefsel construeert en organoids geweest historisch uitdagend. Hier beschrijven we een nieuwe methode gebaseerd op microfluidic bioprinting voor het genereren van een steiger met multilayer interliniëring hydrogel microfibers. Om te bereiken glad is bioprinting, een kern-mantel microfluidic printkop met een samengestelde bioink formulering van de stroom van de kern en de oplossing van de crosslinking gedragen door de flow van de schede, geëxtrudeerd ontworpen en uitgerust op de bioprinter. Door het mengen van gelatine methacryloyl (GelMA) met alginaat, een polysaccharide die ondergaat momentane Ionische crosslinking in aanwezigheid van Selecteer divalente ionen, gevolgd door een secundaire photocrosslinking van de GelMA-component om permanente stabilisatie, een vezelige steiger kan worden verkregen met behulp van deze strategie bioprinting. Nog belangrijker is, kunnen de endotheliale cellen ingekapseld binnen de bioprinted microfibers vormen de lumen-achtige structuren die lijkt op de therapieën in de loop van cultuur 16 dagen. De steiger endothelialized vezelige mogen verder worden gebruikt als een vasculaire bed om te bouwen van een gevacuoliseerd weefsel door latere zaaien van de secundaire celtype in de interstitiële ruimte van de microfibers. Microfluidic bioprinting biedt een algemene strategie in de handige techniek van gevacuoliseerd weefsels op HiFi.

Introduction

Tissue engineering doelen voor het genereren van functionele weefsel vervangers die kunnen worden gebruikt om te vervangen, herstellen of uitbreiden van de gewonde of zieke in het menselijk lichaam^1,2,3,4, vaak door een combinatie van gewenste celtypes, biologische actieve moleculen^5,6en biomaterialen^7,,^8,,^9,10. Meer onlangs, tissue engineering technologieën hebben ook steeds meer aangenomen voor het genereren van in vitro weefsel- en orgaanbanken modellen die na te bootsen van de belangrijke functies van hun in-vivo tegenhangers, voor toepassingen zoals Geneesmiddelenontwikkeling, ter vervanging van de conventionele simplistische vlakke cel culturen^{11,12,13,14,15,16,17,18,19}. In beide gevallen de mogelijkheid om te recapituleren de complexe-microarchitectuur en de hiërarchische structuur van de menselijke weefsels is cruciaal voor het inschakelen van de functionaliteit van de gemodificeerde weefsels¹⁰, en in het bijzonder manieren om een vasculaire netwerk integreren de gemodificeerde weefsels zijn vraag aangezien vascularisatie een van de grootste uitdagingen voor de veld^{20,21,22,23 presenteert}.

Tot op heden, een aantal verschillende benaderingen zijn ontwikkeld in dit opzicht in een poging om te bouwen van bloedvat structuren in gemanipuleerde weefsel constructies met verschillende graden van succes⁸. Bijvoorbeeld, zorgt zelf-assemblage van endotheliale cellen voor generatie van microvasculaire netwerken²⁴; levering van angiogenic groeifactoren induceert aanhoudende neovascularization^25,26; gebruik van vasculaire voorlopercellen en pericytes vergemakkelijkt endothelial celgroei en vergadering^24,27; ontwerpen van steiger eigenschappen maakt nauwkeurige modulatie van vascularisatie^28,29; en celtechnologie blad zorgt voor gemakkelijke manipulatie van vasculaire gelaagdheid³⁰. Deze strategieën doen echter niet de mogelijkheid van beheersing van de ruimtelijke patronen van de therapieën, vaak leidt tot willekeurige distributie van bloedvaten binnen een gemanipuleerde weefsel construct en dus beperkt reproduceerbaarheid begiftigen. Tijdens de afgelopen jaren heeft bioprinting ontpopt als een klasse van basistechnologieën naar de oplossing van dergelijke een uitdaging, als gevolg van hun ongekende veelzijdigheid van het neerleggen van complexe weefsel patronen op HiFi en reproduceerbaarheid in een automatische of semi-geautomatiseerde wijze^31,32,33. Offer bioprinting^34,35,^,36,^,37,38, ingesloten bioprinting^39,40,41, en holle structuur bioprinting/biofabrication^{42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53} hebben al aangetoond dat de haalbaarheid van het genereren van vasculaire of gevacuoliseerd weefsels.

U kunt ook een microfluidic bioprinting strategie te fabriceren vezelige steigers zijn onlangs ontwikkeld, waar een hybride bioink uit alginaat bestaande en gelatine methacryloyl (GelMA) werd geleverd door de kern van een concentrische printkop en een oplossing van calciumchloride (CaCl₂) werd uitgevoerd door de buitenste schede stroom van de printkop^54,55. De co-extrusie van de twee stromen toegestaan voor onmiddellijke fysieke crosslinking van het alginaat onderdeel om microfiber formatie, terwijl latere photocrosslinking gezorgd voor permanente stabilisatie van het multi-layer vezelige schavot. Van de nota, endotheliale cellen ingekapseld binnen de bioprinted microfibers bleken te vermenigvuldigen en migreren naar de periferieën van de microfibers uitgaande van lumen-achtige structuren die de vasculaire bed^54,55geïmiteerd. Deze bioprinted, endothelialized vasculaire bedden kunnen worden vervolgens gevuld met gewenste secundaire celtypes te gevacuoliseerd weefsels⁵⁵verder te bouwen. Dit protocol biedt dus een gedetailleerde procedure van een dergelijke microfluidic bioprinting strategie ingeschakeld door de concentrische mondstuk ontwerp, dat zorgt voor een handige fabricage van gevacuoliseerd weefsels voor potentiële toepassingen in zowel weefselengineering en modellering van de organoid.

Protocol

De neonatale rat cardiomyocytes gebruikt in dit protocol werden geïsoleerd uit 2-dagen oude Sprague-Dawley ratten na een gevestigde procedure56 goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Brigham and Women’s Hospital. 1. de instrumentatie van het Bioprinter Invoegen van een kleinere botte naald (bv, 27 G, 1 inch) als de kern in het midden van een grotere botte naald (bijvoorbeeld, 18 G, ½ inch) als de schede …

Representative Results

De strategie van de bioprinting microfluidic zorgt voor directe extrusie bioprinting van vezelige steigers met lage viscositeit bioinks54,55. Zoals geïllustreerd in Figuur 2A, een steiger met een grootte van 6 × 6 × 6 mm3 bevattende > 30 lagen van microfibers zou bioprinted binnen 10 min. De onmiddellijke Ionische crosslinking van het alginaat onderdeel met CaCl…

Discussion

Bouw van de co-axiale printkop vertegenwoordigt een kritieke stap richting succesvolle microfluidic bioprinting te maken voor de gelijktijdige levering van zowel de bioink van de kern en het crosslinking agent uit de schede. Terwijl dit protocol een voorbeeld van de printkop met een 27G naald als de kern en een naald 18G als de shell gemaakt is, kan het gemakkelijk worden uitgebreid tot een verscheidenheid van combinaties met verschillende maten van naalden. De wijziging in de maten van de naald, die resultaten in de ver…

Materials

Alginic acid sodium salt from brown algae	Sigma-Aldrich	A0682	BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)	Sigma-Aldrich	410896	98%
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10438026	Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001GFP	GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	12430054	High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor