Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per osservare l’embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.
Abstract
Data la natura altamente prevedibile del loro sviluppo, embrioni di Arabidopsis sono stati utilizzati come modello per gli studi della morfogenesi in piante. Tuttavia, primi embrioni di pianta di fase sono piccoli e contengono poche cellule, che li rende difficili da osservare e analizzare. Un metodo è descritto qui per caratterizzare la formazione di pattern in embrioni di pianta sotto un microscopio usando l’organismo modello Arabidopsis. A seguito della liquidazione di ovuli freschi utilizzando soluzione di Hoyer, il numero di cell in e la morfologia degli embrioni ha potuto essere osservati, e loro stadio di sviluppo potrebbe essere determinata da microscopia di contrasto di interferenza differenziale utilizzando un 100x obiettivo d’immersione in olio. Inoltre, l’espressione delle proteine marker specifici contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) è stato monitorato per annotare la specifica identità cellulare durante patterning di embrione di microscopia a scansione laser confocale. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per osservare la formazione di pattern in embrioni di selvaggio-tipo pianta a livello cellulare e molecolare e di caratterizzare il ruolo di geni specifici nel patterning embrione confrontando la formazione di pattern in embrioni da piante wild type e mutanti embrione-letale. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare l’embriogenesi in Arabidopsis.
Introduction
L’embriogenesi è l’evento più iniziale in maggiore sviluppo delle piante. Forma un embrione maturo da uno zigote attraverso divisione delle cellule e differenziazione sotto rigoroso controllo genetico1,2. Embrioni di Arabidopsis sono un modello utile per studiare il controllo della morfogenesi, perché la sequenza di divisioni cellulari durante l’embriogenesi segue un modello previsto3,4. Tuttavia, un embrione di Arabidopsis contenente uno a parecchie cellule è troppo piccolo per essere osservata e analizzata. Inoltre, la mutazione di determinati geni possa causare embrione letalità5, che indica il ruolo chiave di questi geni nell’embriogenesi. La caratterizzazione della formazione di pattern nei mutanti embrione-letale fornisce una base per la comprensione del meccanismo molecolare con cui geni essenziali regolano lo sviluppo dell’embrione.
Un metodo dettagliato è descritto qui per la caratterizzazione di formazione modello dell’embrione nella pianta modello Arabidopsis mediante osservazione microscopica diretta. Il metodo prevede la liquidazione dell’ovulo seguita dall’osservazione al microscopio di un embrione. La caratterizzazione di un mutante di embrione-letale è anche descritto.
La morfologia degli embrioni a diversi stadi di sviluppo può essere determinata direttamente da microscopia utilizzando gli ovuli che sono stati cancellati con soluzione6,7 di Hoyer. Tali ovuli esibiscono un alto indice di rifrazione; così, questo ovulo metodo di compensazione è particolarmente vantaggioso per gli esemplari che devono essere osservati da microscopia (DIC) contrasto differenziale di interferenza.
Inoltre, i geni che sono espressi in una determinata cella o un numero limitato di cellule durante l’embriogenesi utilizzabile come marcatori per identificare le cellule di un embrione. Pertanto, la specifica identità cellulare durante l’embriogenesi può essere annotata monitorando l’espressione della GFP-etichettato marker proteici mediante microscopia a scansione laser confocale. Al contrario, osservando il pattern di espressione di un gene funzionale sconosciuto –GFP fusione durante l’embriogenesi può fornire un collegamento tra embrione patterning e l’espressione di quel gene e facilitare l’identificazione di nuovi geni che sono necessari per l’embriogenesi in Arabidopsis.
Il metodo qui descritto è utilizzabile anche per caratterizzare il fenotipo di un embrione-letale mutante e per determinare l’impatto del gene interessato su embriogenesi a livello cellulare. Inoltre, in combinazione con un confronto del modello di espressione dei geni marcatori durante l’embriogenesi tra piante wild-type e mutanti, il metodo può produrre indizi circa i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella embriogenesi8,9. Infatti, il metodo è stato applicato agli impianti di naa10 , e si è constatato che la divisione anormale del hypophysis nel mutante può essere causata da un cambiamento nella distribuzione dell’auxina durante l’embriogenesi5.
Protocol
Representative Results
Discussion
La clearance dell’ovulo è un metodo utile per rilevare la divisione cellulare e valutare morfologia durante l’embriogenesi in Arabidopsis; utilizzando questa tecnica, gli embrioni possono essere osservati direttamente nel DIC microscopia5,12. Il passaggio fondamentale per lo sdoganamento dell’ovulo è punto 1.3.4. Il tempo richiesto per lo sdoganamento dell’ovulo nel passaggio 1.3.4 è variabile. Embrioni allo stadio di 2/4-cellule possono essere osserv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Jessica Habashi per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Dr. Xianyong Sheng di Imaging Center, College di Scienze della vita, Capital Normal University (Cina), per eseguire la localizzazione del dosaggio di DR5-GFP . Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Beijing Municipal governo Science Foundation (CIT & TCD20150102) e dal National Natural Science Foundation of China (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
