Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis
Summary
Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.
Abstract
Dada a natureza altamente previsível do seu desenvolvimento, embriões de Arabidopsis tem sido usados como um modelo para estudos da morfogênese em plantas. No entanto, embriões adiantados de planta de palco são pequenos e contêm poucas células, tornando-os difíceis de observar e analisar. Um método é descrito aqui para caracterizar a formação padrão em embriões de planta sob um microscópio usando o organismo modelo Arabidopsis. Após o afastamento de óvulos frescos usando solução de Hoyer, o número do celular na e morfologia de embriões podem ser observadas, e seu estágio desenvolvente poderia ser determinado por microscopia de contraste de interferência diferencial usando um 100 X lente de imersão de óleo. Além disso, a expressão de proteínas marcador específico marcados com proteína fluorescente verde (GFP) foi monitorada para anotar a especificação de identidade celular durante a padronização do embrião por laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Assim, este método pode ser usado para observar a formação de padrão em embriões de planta selvagem-tipo a nível celular e molecular e caracterizar o papel de genes específicos na padronização do embrião, comparando a formação padrão em embriões de plantas de tipo selvagem e mutantes embrião letal. Portanto, o método pode ser usado para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis.
Introduction
Embriogénese é o evento mais antigo no maior desenvolvimento da planta. Um formas de embrião maduro de um zigoto através de divisão celular e diferenciação sob estrito controle genético1,2. Embriões de Arabidopsis são um modelo útil para estudar o controle da morfogênese, porque a sequência de divisões celulares durante a embriogênese segue um padrão esperado3,4. No entanto, um embrião de Arabidopsis contendo um para várias células é muito pequeno para ser observados e analisados. Além disso, a mutação de certos genes pode causar embrião letalidade5, indicando o papel chave daqueles genes na embriogênese. A caracterização da formação padrão nos mutantes embrião letal fornece uma base para a compreensão do mecanismo molecular pelo qual genes essenciais regulam o desenvolvimento do embrião.
Um método detalhado é descrito aqui para a caracterização da formação de embrião padrão na planta modelo Arabidopsis por observação microscópica directa. O método envolve afastamento ovule, seguido pela observação microscópica de um embrião. A caracterização de um embrião letal mutante também é descrita.
A morfologia dos embriões em diferentes estádios de desenvolvimento pode ser determinada diretamente pela microscopia usando os óvulos que tenham sido limpos com solução6,7 da Hoyer. Esses óvulos apresentam um elevado índice de refração; assim, esta ovule método de compensação é especialmente vantajoso para as amostras que devem ser observadas por microscopia de contraste (DIC) de interferência diferencial.
Além disso, os genes que são expressos em uma célula específica ou um número limitado de células durante a embriogênese podem ser utilizados como marcadores para identificar as células de um embrião. Portanto, a especificação de identidade de células durante a embriogênese pode ser anotada pelo monitoramento a expressão de proteínas GFP-etiquetado marcador usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Por outro lado, observar o padrão de expressão de um gene funcional desconhecida –GFP fusão durante a embriogênese pode fornecer um link entre a padronização do embrião e a expressão do gene que e facilitar a identificação de novos genes que são necessários para embriogênese em Arabidopsis.
O método aqui descrito também pode ser usado para caracterizar o fenótipo de um embrião letal mutante e para determinar o impacto do gene afetado na embriogênese a nível celular. Além disso, em combinação com uma comparação do padrão de expressão de genes marcadores durante a embriogênese entre plantas tipo selvagem e mutantes, o método pode gerar pistas sobre os mecanismos moleculares e vias de sinalização envolvidas na embriogênese8,9. Com efeito, o método foi aplicado a naa10 plantas, e verificou-se que a divisão anormal da hipófise no mutante pode ser causada por uma alteração da distribuição da auxina durante a embriogênese5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afastamento do ovule é um método útil para a detecção de divisão celular e avaliar morfologia durante a embriogênese em Arabidopsis; usando esta técnica, embriões podem ser observados diretamente sob microscopia DIC5,12. O passo fundamental para a liberação do óvulo é passo 1.3.4. O tempo necessário para o apuramento do ovule na etapa 1.3.4 é variável. Embriões no estágio de 2/4-cell podem ser observados claramente após 2 h na soluçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Jessica Habashi pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos o Dr. Xianyong Sheng do centro de imagiologia, faculdade de ciências biológicas, Universidade Normal de Capital (Pequim, China), para realizar a localização do ensaio DR5-GFP . Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Municipal de ciência governo de Pequim (CIT & TCD20150102) e da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
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