생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

요약

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

초록

대부분의 현 화 식물에 어머니 조직에 깊이 숨겨진 zygote과 태아 하 고 따라서 그것은 오래. 개발 방법의 신비 예를 들어는 zygote 몸 축 설정 하에서 어떻게 하 고 어떻게 태아 장기 형성 동안 다양 한 세포 운명을 지정 합니다. 이 원고는 체 외에 난 문화 메서드를를 라이브 셀 이미징 zygotes과 애기 thaliana의 배아 개발에 대해 설명 합니다. 최적화 된 재배 매체 zygotes 또는 초기 배아 비옥한 식물에 성장 수 있습니다. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar 배열 장치와 함께 그것을 결합 하 여는 난 같은 위치에 액체 매체에서 개최 됩니다. 이 기정은 늦은 배아 단계에 zygotic 부문에서 몇 일 동안 관찰 하는 현미경 같은 난 중요 합니다. 결과 라이브 셀 이미징 핵 이동 및 골격 재배열, 및 또한 세포 분열 타이밍 및 배아 패턴화 하는 동안 세포 운명 명세와 같은 접합 자 분극의 실시간 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 배아 개발, 다양 한 요인의 영향을 분석할 억제제 치료와 레이저-셀 통신의 역할을 검토 중단 등 광학 조작이 난 재배 시스템에 결합할 수 있습니다.

서론

체의 기본적인 몸 계획 단 세포 접합 자에서 개발 한다. 대부분 꽃 식물, zygotic 사업부는 꼭대기와 촬영 및 루트, 각각¹로 발전 하는 기저 세포를 생성 합니다. 따라서, embryogenesis, 동안 식물 몸은 형성 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 하다 하지만 그들은 꽃에서 깊은 곳에서 개발 하기 때문에 직접 생활 zygotes 및 배아의 역학을 관찰 하는 효과적인 도구가 되지 않았습니다. 옥수수, 쌀, 등 여러 monocot 종, 체 외에서 수정 방법 설립된^2,3되었습니다. 이 방법에서는, 고립 된 정자 및 난 자 세포 융합 하는 전기적 또는 화학적으로, 그리고 생성 된 셀 비옥한 식물으로 개발할 수 있습니다. 그러나, dicot 식물, 체 외에서 수정 방법 남성과 여성 gametes^4,5의 세포 주기 비 동기화 상태 때문에 아마도 적절 한 배아를 생산할 수 있다. 또한, 태아를 둘러싼 조직 (endosperm) 배아 개발⁶에 중요 한 역할을 담당합니다.....

프로토콜

1. 준비 체 외에 난 배양의

1. 확인 생체 외에서 난 문화에 대 한 액체 매체 (" N5T 매체 ") 1 x Nitsch 기초 소금 혼합물, 5% (w/v) 트 레 할 로스가 수화물, 0.05 포함 하 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산 (MES)-코 (pH 5.8), 및 1 x Gamborg ' s 비타민 솔루션.
2. 코와 5.8에 pH를 조정.
3. 압력가 마로 소독 하 여 매체 소독 (121 ° C, 20 분) 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
   참고: 소독된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 2-3 개월.

2. PDMS Micropillar 배열 장치 준비

1. PDMS micropillar 장치 칼, 면도날 또는 35 m m 유리 하단 접시의 유리 부분 (14 m m φ)에 맞게가 위로 잘라.
   참고: 이전 논문 ^{8 , 9}, PDMS 장치 건설의 전체 절차를 설명 하 고 여기에 세부 사항을 생략 됩니다 따라서. 4 잘 또는 96 ....

결과

이 난 재배 시스템을 사용 하 여이 메서드는 zygote 분극 및 모방 하는 태아의 생활 역학을 추적할 수 있습니다. 이 때문에 이전 zygote와 배아, 어머니 조직에 깊이 숨겨져 있는 실시간 동작을 시각화 하 아무 기술 성과 이다. 그림 3A 와 보조 비디오 1 젊은 zygote에서 microtubules (MTs) subapical 지역¹⁰가로 링 축적 보여준다. 이 산 반지는 zygote elongates 꼭대기 방향에 하는 동안 유지 됩니다. Zygote 신장 및 꼭대기 지역에 핵 마이그레이션 완료 후 산 반지 사라진다 고는 MTs 형성 DNA를 분리 하는 스핀 들. 그림 3B 와 보조 비디오 2 배아 세포 전할 radially 대칭 구형 모양

토론

이 원고는 간단한 체 외에 난 재배 하는 프로토콜 zygotes와 배아 개발의 라이브 셀 이미징에 사용 하기 위해 효율적인 소개 합니다.

PDMS 장치 디자인은 배아 단계에 따라 최적화를 할 수 있습니다. 첫 번째 개발된 장치 microcage 배열 방향을 조정 하 고 수정 ovules⁹의 위치를 그리고 다음 micropillar 장치 ovules를 보다 효율적으로 함정을 건설 되었다⁸. 또한,는 micropillars 얇고는 microcage 보다 되며 따라서 장기적인 관찰 하는 동안 난 확장을 방지 하지 않습니다. 이 micropillar 장치는 배아 심장 단계⁸까지 zygotic 단계에서 몇 일 동안 한 난을 저장할 수 있습니다. 그러나 궁극적으로,, 완전히 확장된 난의 높이 micropillar 높이 초과 하면 고 따라서 멀리 장.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nitsch 기초 소금 혼합물	Duchefa	N0223
트레할로스 이수화물	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg' s 비타민 솔루션	Sigma-Aldrich	G1019
35mm 유리 바닥 접시	Matsunami 유리	D111300
35mm 문화 접시	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm 슬라이드 유리	Matsunami 유리	S1225
18 × 18 mm 슬라이드 유리	Matsunami 유리	C018181
바늘 (게이지 0.40 mm)	Terumo	NN-2719S
침수 매체 Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		맞춤형 장비이므로 카탈로그 번호는 사용할 수 없습니다.
CV1000	요코가와 전기	CV1000-SP84