Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Summary

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Abstract

La cartilagine articolare umana manca la capacità di ripararsi. La degenerazione di cartilagine viene quindi trattata non da curative ma da trattamenti conservatori. Attualmente si stanno impegnando a rigenerare la cartilagine danneggiata con condrociti espansi ex vivo o cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSCs). Tuttavia, la restrittività e l'instabilità di queste cellule limitano la loro applicazione nella ricostruzione della cartilagine. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) hanno ricevuto l'attenzione scientifica come una nuova alternativa per le applicazioni rigenerative. Con abilità illimitate di auto-rinnovamento e multipotenza, i hiPSCs sono stati evidenziati come una nuova sorgente di sostituzione cellulare per la riparazione della cartilagine. Tuttavia, l'ottenimento di un'elevata quantità di pellets condizionati di alta qualità è una sfida importante per la loro applicazione clinica. In questo studio abbiamo usato cellule embrionali (EB) derivate per la differenziazione condrogenica. La chondrogenesi di successo è stata confermata da PCRD con blu alcian, toluidina blu e anticorpi contro i tipi di collagene I e II (COL1A1 e COL2A1 rispettivamente). Forniamo un metodo dettagliato per la differenziazione dei iPSC (CBMC-hiPSCs) derivati ​​da cellule mononucleari di sangue del cordone in pellet condondenso.

Introduction

L'uso di hiPSC rappresenta una nuova strategia per lo screening dei farmaci e studi meccanistici di varie malattie. Da una prospettiva rigenerativa, i hiPSC sono anche una potenziale fonte per la sostituzione di tessuti danneggiati che hanno capacità di guarigione limitata, come la cartilagine articolare ^{1 , 2} .

La rigenerazione della cartilagine articolare nativa è stata una sfida per diversi decenni. La cartilagine articolare è un morbido tessuto bianco che copre la fine delle ossa, proteggendole dall'attrito. Tuttavia, ha una capacità di rigenerazione limitata quando è danneggiata, rendendo quasi impossibile l'auto-riparazione. Pertanto, la ricerca incentrata sulla rigenerazione della cartilagine è stata in corso per diversi decenni.

In precedenza, la differenziazione in vitro nel linfodondrogeno è stata normalmente eseguita con BMSC o condrociti naturali isolati dall'articolazione del ginocchio ³ . DovutoO il loro potenziale condrogenico, BMSC e condrociti nativi hanno numerosi meriti che sostengono il loro utilizzo nella condogenesi. Tuttavia, a causa della loro limitata espansione e del fenotipo instabile, queste cellule presentano numerose limitazioni nella ricostruzione dei difetti della cartilagine articolare. Sotto le condizioni di coltura in vitro , queste cellule tendono a perdere le proprie caratteristiche dopo 3-4 passaggi, che infine influenzano le loro capacità di differenziazione ⁴ . Inoltre, nel caso dei condrociti nativi, un danno aggiuntivo per il ginocchio è inevitabile quando si ottiene queste cellule.

A differenza di BMSC o di condrociti nativi, i hiPSCs possono espandersi indefinitamente in vitro . Con le condizioni di coltura adeguate, i hiPSC hanno un grande potenziale come fonte di ricambio per la differenziazione condrogenica. Tuttavia, è impegnativo cambiare le caratteristiche intrinseche di hiPSCs ⁵ . Inoltre, ci sono diversi complicati in vitro stePs per dirigere il destino di hiPSCs a un tipo specifico di cella. Nonostante queste complicazioni, l'uso di hiPSC è ancora raccomandato a causa delle loro elevate capacità di auto-rinnovamento e della loro capacità di differenziarsi in cellule mirate, compresi i condrociti ⁶ .

La differenziazione condrogenica è di solito effettuata con sistemi di coltura tridimensionali, come la coltura di pellet o la coltura di micromassi, utilizzando le cellule progenitrici MSC. Se si usa hiPSCs, il protocollo per generare le cellule progenie di MSC è diverso dai protocolli esistenti. Alcuni gruppi usano la cultura monolayer di hiPSC per convertire direttamente il fenotipo in cellule simili a MSC ⁷ . Tuttavia, la maggior parte degli studi utilizza EB per generare cellule di crescita che assomigliano a MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Vari tipi di fattori di crescita sono utilizzati per indurre il chondrogeNesis. Di solito, le proteine ​​familiari BMP e TGFβ vengono utilizzate, da soli o in combinazione. La differenziazione è stata anche indotta con altri fattori, come GDF5, FGF2 e IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . TGFβ1 è stato dimostrato di stimolare la condogenesi in modo dose-dipendente nei MSC ¹⁶ . Rispetto all'altro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce la condogenesi aumentando la condensazione delle cellule mesenchimali pre-cartilagine. TGFβ3 induce la condogenesi aumentando significativamente la proliferazione cellulare mesenchimale ¹⁷ . Tuttavia, TGFβ3 viene utilizzato più frequentemente dai ricercatori di TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 aumenta l'espressione di geni relativi ai componenti della matrice condrogenica nell'uomoCondrociti articolari sotto condizioni in vitro ²⁰ . BMP2 aumenta l'espressione di geni critici alla formazione di cartilagine nei MSC in combinazione con le proteine ​​TGFβ ²¹ . È stato inoltre dimostrato che BMP2 valorizza sinergicamente l'effetto di TGFβ3 attraverso i percorsi Smad e MAPK ²² .

In questo studio CBMC-hiPSCs sono stati aggregati in EB utilizzando mezzo EB in un piatto di Petri a basso assorbimento. Le cellule di crescita sono state indotte collegando i EB a un piatto rivestito di gelatina. La differenziazione condrogenica usando le cellule di crescita è stata eseguita con la coltura del pellet. Il trattamento con entrambi BMP2 e TGFβ3 ha condensato con successo le cellule e l'accumulo di proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) indotta per la formazione di pellet condrogenico. Questo studio suggerisce un semplice ma efficace protocollo di differenziazione dei condensatori usando CBMC-hiPSCs.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale dell'Università Cattolica della Corea (KC12TISI0861). I CBMC utilizzati per la riprogrammazione sono stati direttamente ottenuti dalla Banca di Cord Blood del Seoul St. Mary's Hospital. 1. Differenziazione condensata da iPSC Generazione CBMC-iPSC Generare CBMC-hiPSC utilizzando il protocollo mostrato nel nostro lavoro precedente 23 . Ra…

Representative Results

In questo studio, abbiamo generato pellet condensatori da CBMC-hiPSCs indurre cellule outgrowth da EBs. La differenziazione condrogenica è stata indotta usando CBMC-hiPSC con elevata pluripotenza 11 confermata. Uno schema semplice del nostro protocollo è mostrato in Figura 1A . Prima della differenziazione, le colonie iPSC sono state ampliate ( Figura 1B ). IPSC espansi sono stati assemblati come EB per…

Discussion

Questo protocollo ha generato hiPSC da CBMC. Abbiamo riprogrammato i CBMC a hiPSC utilizzando un vettore virale Sendai contenente fattori Yamanaka ²⁴ . Tre casi sono stati utilizzati nella differenziazione, e tutti gli esperimenti hanno generato con successo i pellet condrodotti utilizzando questo protocollo. Numerosi studi hanno riportato protocolli per la differenziazione dei hiPSC nei condrociti ^{25 , 26 , 2…}

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)