Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell
Summary
Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.
Abstract
Das Vorhandensein von Bakterien als strukturierte Biofilme bei chronischen Wunden, insbesondere bei Diabetikern, wird gedacht, um die Wundheilung und Auflösung zu verhindern. Chronische Wunden Mausmodellen wurden verwendet, die zugrundeliegenden Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und dem Host zu verstehen. Die bisher entwickelten Modelle setzen auf kurzhaarige Tiere und terminal Sammlung von Wundgewebe zur Bestimmung der lebensfähigen Bakterien. Während mit diesen Modellen erhebliche Einblick gewonnen wurde, dieses experimentelle Verfahren erfordert eine große Anzahl von Tieren und Probenahme ist zeitaufwendig. Haben wir eine neuartige Mausmodell, das beinhaltet mehrere optimale Innovationen um Biofilm Progression bei chronischen Wunden zu bewerten: ein) es nutzt haarlose Mäusen, wodurch die Notwendigkeit für die Haarentfernung; (b) bezieht sich auf die Wunden ermöglicht die sofortige Auswertung der Persistenz und Wirkung dieser Gemeinschaften auf Host vorgeformte Biofilme; (c) überwacht die Biofilm Fortschreiten durch leichte Produktion durch eine gentechnisch Biolumineszenz Belastung von Pseudomonas Aeruginosa, ermöglicht Echtzeit-Überwachung von der Infektion, wodurch die Anzahl der Tiere pro Studie zu quantifizieren. In diesem Modell eine einzelne ganzer Tiefe Wunde auf der Rückseite des STZ-induzierte diabetischen haarlosen Mäusen produziert und mit Biofilmen von p. Aeruginosa Biolumineszenz Stamm Xen 41 geimpft. Lichtleistung von den Wunden ist in ein in-Vivo imaging-System, so dass für die in Vivo und in Situ schnelle Biofilm-Visualisierung und Lokalisierung von Biofilm-Bakterien in die Wunden täglich aufgezeichnet. Diese neuartige Methode ist flexibel, es kann verwendet werden, um andere Mikroorganismen, einschließlich gentechnisch veränderter Arten und Multi-Spezies Biofilme zu studieren und möglicherweise von besonderem Wert in Anti-Biofilm Prüfstrategien einschließlich antimikrobielle okklusiven Dressings.
Introduction
Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen eingebettet in eine Matrix aus Polymeren Substanzen, die als Faktor für die schlechte Auflösung von chronischen Wunden1hervorgehoben worden sind. Die Studie dieser hoch organisierten, anhaltende mikrobiellen Populationen ist besonders wichtig für Diabetes-Patienten schlechter Durchblutung der Gliedmaßen und geänderten peripheren sensorischen Mechanismen führen zu unerkannten Läsionen2. In den Vereinigten Staaten wird geschätzt, dass 15 % der Diabetes-Patienten im Laufe ihres Lebens mindestens ein Geschwür entwickeln wird. Dies führt zu einem wirtschaftlichen Aufwand von rund 28 Milliarden Dollar in Behandlung3,4, um ganz zu schweigen von unschätzbarem emotionale und soziale Belastung. Verständnis der Faktoren, die es mikrobielle Gemeinschaften ermöglichen bestehen in das Wundbett und die Auswirkungen, die diese Biofilme an den heilenden Veranstaltungen unbedingt bessere Betreuung für die betroffenen Patienten fahren und treiben die Entwicklung neuer Therapieansätze. Daher ist die Einrichtung von reproduzierbar und übersetzbar in Vivo Modellen für die Erkundung von Bakterien-Wirt Interaktionen von größter Bedeutung.
Murinen Modelle wurden erfolgreich entwickelt, um die Auswirkungen von Biofilmen bei chronischen Wunden zu untersuchen. Diese Modelle jedoch oft behaarte Arten nutzen und bewerten Biofilm Abstand von Platte Grafen für tragfähige Bakterienzellen von ausgeschnittenen Gewebe von geopferten Tiere, wodurch sie Zeit- und kostenintensiv.
Eine biophotonische Alternative zum Endpunkt Probenahme von Tieren bei der Bewertung von Infektion wurde zuerst von Contag Et al.vorgeschlagen. (1995) 5 , , entwickelt eine Methode, Lumineszenz von konstitutiv Biolumineszenz Salmonella Typhimurium zur Messung der Wirksamkeit der antibiotischen Behandlung zu erfassen. Andere Studien, die unter Ausnutzung der Biolumineszenz-emittierende Bakterien gefolgt. Z. B. Rocchetta Et Al. (2001) 6 validiert eine Infektionsmodell Oberschenkel Escherichia coli -Infektionen bei Mäusen durch die Messung der Lumineszenz, die mit einer verstärkten Coupled Ladegerät – studieren und später, Kadurugamuwa Et Al. (2003) 7 nutzten das Photon emittierenden Eigenschaften ein veränderter Stamm von Staphylococcus Aureus , die Wirksamkeit der verschiedenen Antibiotika in einem Katheter-Wunde-Modell bei Mäusen zu untersuchen.
Die Methode zeichnet sich hier stellt eine einfache Protokoll um Diabetes in haarlosen Mäusen zu induzieren, produzieren und Wunden mit vorgeformten Biolumineszenz Biofilmen von p. Aeruginosa, impfen und biophotonische Überwachung der Infektion mit Hilfe einer in-Vivo imaging-System. Es bietet eine direkte, Rapid, in Situ, nicht invasiv und quantitativen Prozess, Biofilme bei chronischen Wunden zu bewerten und darüber hinaus für die zusätzliche Analyse ermöglicht, wie mikroskopische Bildgebung des Heilens Wunden, intermittierende Blutentnahme für Zytokin-Messungen und terminal Gewebe Kollektion für Histologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein neue Mausmodell für die Untersuchung von Biofilmen bei diabetischen chronischen Wunden, das viele Vorteile um eine reproduzierbare, übersetzbar und flexible Modell zu erstellen.
Die erste Neuerung ist die Verwendung von haarlosen Mäusen. Andere Mausmodelle wurden entwickelt, um diabetische Chronische Wundheilungsstörungen10,11studieren, aber alle haben stützte sich auf die Verwendung von Haaren Mäuse, die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte der American Diabetes Association für die Unterstützung dieser Arbeit (Grant # #7-13-BS-180), der Michigan State Universität Technologie Unterstützung Forschungseinrichtung für die Bereitstellung von Ausbildung und Zugang zu den in-Vivo imaging-System und die Michigan State University Investigative Histopathologie Lab für die Verarbeitung der Maus Biopsien zur histopathologischen Untersuchung.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
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