प्रकाश की ओर आओ: Vivo निगरानी में Pseudomonas aeruginosa एक मधुमेह गंजा Murine मॉडल में क्रोनिक घावों में फिल्म संक्रमण
Summary
यहाँ हम एक उपंयास मधुमेह murine मॉडल वास्तविक समय के लिए गंजा चूहों का उपयोग का वर्णन, गैर इनवेसिव, bioluminescent Pseudomonas aeruginosaकी फिल्म घाव संक्रमण की निगरानी । यह विधि अन्य जीवाणु प्रजातियों के संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और बहु प्रजातियों के साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित सूक्ष्मजीवों, सहित, और antibiofilm रणनीतियों की प्रभावकारिता का परीक्षण.
Abstract
पुराने घावों में संरचित फिल्म के रूप में बैक्टीरिया की उपस्थिति, विशेष रूप से मधुमेह के रोगियों में, घाव भरने और संकल्प को रोकने के लिए सोचा है । जीर्ण माउस घाव मॉडल सूक्ष्मजीवों और मेजबान के बीच अंतर्निहित बातचीत को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है । तिथि करने के लिए विकसित मॉडल व्यवहार्य बैक्टीरिया के निर्धारण के लिए बालों वाले जानवरों और घाव ऊतक के टर्मिनल संग्रह के उपयोग पर भरोसा करते हैं । हालांकि महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि इन मॉडलों के साथ प्राप्त किया गया है, इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया जानवरों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है और नमूना समय लगता है । हम एक उपंयास murine मॉडल है कि कई इष्टतम नवाचारों को शामिल किया है जीर्ण घावों में फिल्म प्रगति का मूल्यांकन: एक) यह गंजा चूहों का इस्तेमाल, बालों को हटाने के लिए की जरूरत को नष्ट करने; ख) पूर्व का गठन लागू होता है के लिए अनुमति घाव हठ और मेजबान पर इन समुदायों के प्रभाव के तत्काल मूल्यांकन के लिए दे; ग) के एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर bioluminescent तनाव द्वारा प्रकाश उत्पादन को बढ़ाता द्वारा Pseudomonas aeruginosaकी निगरानी, इस प्रकार के अध्ययन के प्रति आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करने के संक्रमण के वास्तविक समय की मॉनिटरिंग की अनुमति देने के द्वारा एक फिल्म प्रगति पर नज़र रखता है । इस मॉडल में, एक एकल पूर्ण गहराई घाव STZ प्रेरित मधुमेह गंजा चूहों की पीठ पर उत्पादित है और पी aeruginosa bioluminescent तनाव Xen ४१ की फिल्म के साथ inoculated । घावों से प्रकाश उत्पादन में एक vivo इमेजिंग प्रणाली में दैनिक दर्ज की गई है, vivo में और सीटू रैपिड में एक फिल्म दृश्य और घावों के भीतर फिल्म बैक्टीरिया के स्थानीयकरण में अनुमति देता है । इस उपंयास विधि लचीला है के रूप में यह आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रजातियों और बहु प्रजातियों के फिल्म सहित अंय सूक्ष्मजीवों, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और परीक्षण विरोधी रोगाणुरोधी पूर्णावरोधक ड्रेसिंग सहित फिल्म रणनीतियों में विशेष मूल्य का हो सकता है ।
Introduction
फिल्मी सूक्ष्मजीवों बहुलक पदार्थ है कि जीर्ण घावों के गरीब संकल्प के लिए एक योगदान कारक के रूप में प्रकाश डाला गया है की एक मैट्रिक्स में एंबेडेड के जटिल समुदायों रहे है1। इन उच्च संगठित, लगातार माइक्रोबियल आबादी के अध्ययन के मधुमेह के रोगियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां अंगों और बदल परिधीय संवेदी तंत्र पर गरीब संचलन2नहीं पता चला घावों को ले । संयुक्त राज्य अमेरिका में, यह अनुमान लगाया गया है कि मधुमेह के रोगियों के 15% उनके जीवन के पाठ्यक्रम के दौरान कम से कम एक अल्सर का विकास होगा । यह उपचार में लगभग २८,०००,०००,००० डॉलर के आर्थिक व्यय3,4, नहीं immensurable भावनात्मक और सामाजिक बोझ का उल्लेख करने के लिए अनुवाद । कारकों को समझना है कि माइक्रोबियल समुदायों को घाव बिस्तर में जारी रखने की अनुमति और प्रभाव इन फिल्मों चिकित्सा की घटनाओं में है करने के लिए प्रभावित रोगियों के लिए बेहतर देखभाल ड्राइव और नए उपचार के दृष्टिकोण के विकास में वृद्धि आवश्यक है । इसलिए, बैक्टीरियल होस्ट बातचीत की खोज के लिए vivo मॉडल में प्रतिलिपि और अनुवाद की स्थापना सर्वोपरि है ।
Murine मॉडल सफलतापूर्वक पुराने घावों में फिल्म के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इन मॉडलों को, तथापि, अक्सर बालों वाली प्रजातियों का उपयोग और थाली द्वारा फिल्म की मंजूरी का मूल्यांकन कर रहे है बलि पशुओं से उत्पाद के ऊतकों की व्यवहार्य बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए मायने रखता है, उंहें समय लेने और महंगा ।
संक्रमण के मूल्यांकन में पशुओं के अंत बिंदु नमूने के लिए एक biophotonic विकल्प पहले Contag एट अलद्वारा प्रस्तावित किया गया था । (१९९५) 5 , जिसने एंटीबायोटिक उपचार प्रभावकारिता को मापने के लिए constitutively bioluminescent साल्मोनेला typhimurium से luminescence को पकड़ने के लिए एक विधि विकसित की. अंय अध्ययनों से bioluminescence उत्सर्जक बैक्टीरिया का लाभ लेने के बाद । उदाहरण के लिए, Rochetta एट अल। (२००१) 6 एक संक्रमण मॉडल एक तेज चार्ज-युग्मित डिवाइस का उपयोग कर luminescence को मापने और बाद में, Kadurugamuwa एट अलद्वारा चूहों में ई कोलाई जांघ संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मान्य । (२००३) 7 चूहों में एक कैथेटर घाव मॉडल में कई एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस के एक इंजीनियर तनाव के फोटॉन उत्सर्जक गुणों का लाभ लिया ।
विधि यहां विशेषता गंजा चूहों में मधुमेह के लिए प्रेरित करने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, उत्पादन और पूर्व के साथ लगाना घाव- पी. aeruginosa की bioluminescentी का गठन, और संक्रमण के biophotonic निगरानी आचरण एक vivo में इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करना । यह एक प्रत्यक्ष, तेजी से प्रदान करता है, सीटू में, गैर इनवेसिव और मात्रात्मक प्रक्रिया पुरानी घावों और इसके अलावा में, का मूल्यांकन करने के लिए इस तरह के उपचार के सूक्ष्म इमेजिंग के रूप में अतिरिक्त विश्लेषण के लिए अनुमति देता है घाव, आंतरायिक रक्त संग्रह के लिए cytokine माप, और प्रोटोकॉल के लिए टर्मिनल ऊतक संग्रह ।
Protocol
पशु प्रयोगों को मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने मंजूरी दी थी ।
1. पूर्णावरोधक ड्रेसिंग और सिलिकॉन स्पेसर्स की तैयारी पारदर्शी पूर्णावरोधक ड्रेस…
Representative Results
Discussion
यहां हम मधुमेह क्रोनिक घाव है कि कई फायदे के लिए एक प्रतिलिपि, अनुवाद, और लचीला बनाने के मॉडल है में फिल्म के अध्ययन के लिए एक नया माउस मॉडल का वर्णन ।
पहले नवाचार गंजा चूहों का उपयोग है । अंय मा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इस काम के समर्थन के लिए अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा (अनुदान # #7 -13-बी एस-१८०), मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के अनुसंधान के लिए प्रशिक्षण और पहुंच प्रदान करने के लिए प्रौद्योगिकी सहायता सुविधा vivo इमेजिंग प्रणाली में और histopathological परीक्षा के लिए माउस बायोप्सी के प्रसंस्करण के लिए मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय खोजी Histopathology लैब ।
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
