Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico
Summary
Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l’efficacia delle strategie di antibiofilm.
Abstract
La presenza di batteri come strutturato biofilm nelle ferite croniche, soprattutto in pazienti diabetici, è pensata per impedire la guarigione della ferita e la risoluzione. Modelli di ferite croniche del mouse sono stati utilizzati per comprendere le interazioni sottostante tra i microrganismi e l’host. I modelli sviluppati fino ad oggi si basano sull’uso di animali dai capelli e terminale raccolta di tessuto arrotolato per determinazione di batteri vitali. Mentre significativa intuizione è stata acquisita con questi modelli, questa procedura sperimentale richiede un gran numero di animali e il campionamento è che richiede tempo. Abbiamo sviluppato un nuovo modello murino che incorpora diverse innovazioni ottimale per valutare la progressione di biofilm nelle ferite croniche: un) utilizza i topi glabri, eliminando la necessità di rimozione dei capelli; b) riferisce biofilm preformato le ferite consentendo l’immediata valutazione della persistenza e l’effetto di queste comunità su host; c) controlla la progressione di biofilm quantificando la produzione di luce da un ceppo geneticamente bioluminescente di Pseudomonas aeruginosa, che permette di monitorare in tempo reale l’infezione riducendo così il numero di animali necessari per studio. In questo modello, una singola ferita piena profondità è prodotta sul retro dei topi glabri diabetici indotto STZ e inoculata con biofilm del ceppo bioluminescente p. aeruginosa 41 Xen. Emissione luminosa dalle ferite è registrato giornalmente in un in vivo imaging sistema, consentendo la visualizzazione rapida di biofilm in vivo e in situ e localizzazione di biofilm batteri all’interno le ferite. Questo nuovo metodo è flessibile in quanto esso può essere usato per studiare altri microrganismi, tra cui specie geneticamente e multispecie biofilm e può essere di particolare valore in test strategie anti-biofilm compreso antimicrobiche medicazioni occlusive.
Introduction
I biofilm sono comunità complesse di microrganismi incorporati in una matrice di sostanze polimeriche che sono stati evidenziati come un fattore di contributo per la scarsa risoluzione di ferite croniche1. Lo studio di queste popolazioni microbiche altamente organizzate, persistente è particolarmente importante per i pazienti diabetici dove cattiva circolazione sugli arti e alterati meccanismi sensoriali periferici portare a lesioni inosservato2. Negli Stati Uniti, si stima che il 15% dei pazienti diabetici svilupperà almeno una ulcera nel corso della loro vita. Questo si traduce in un dispendio economico di circa 28 miliardi dollari nel trattamento3,4, per non parlare l’incommensurabile onere emotivo e sociale. Comprensione dei fattori che consentono le comunità microbiche a persistere nel letto della ferita e l’impatto che questi biofilm avere negli eventi guarigione è imperativa di guidare la migliore cura per pazienti affetti e spingere lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Di conseguenza, la creazione di modelli riproducibili e traducibili in vivo per esplorare le interazioni batteriche-ospite è di primaria importanza.
Modelli murini sono stati sviluppati con successo per studiare l’impatto di biofilm nelle ferite croniche. Questi modelli, tuttavia, spesso utilizzano specie dai capelli e valutare biofilm liquidazione mediante conta su piastra per cellule vitali batteriche del tessuto asportato da animali sacrificati, che li rende lungo e costoso.
Un’alternativa Biofotonico per il campionamento di punto finale degli animali nella valutazione infezione fu proposta da Contag et al. (1995) 5 , che ha sviluppato un metodo per catturare luminescenza da costitutivamente bioluminescenti Salmonella typhimurium per misurare l’efficacia del trattamento antibiotico. Altri studi approfittando dei batteri che emettono bioluminescenza seguita. Ad esempio, Rochetta et al. (2001) un modello di infezione per studiare le infezioni di coscia di Escherichia coli in topi misurando luminescenza utilizzando un’intensificata charge coupled device convalidato 6 e versioni successive, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 ha approfittato del fotone emissione di proprietà di un derivati dal ceppo di Staphylococcus aureus per studiare l’efficacia di diversi antibiotici in un modello di ferita del catetere in topi.
Il metodo caratterizzato qui presenta un semplice protocollo per indurre il diabete in topi glabri, produrre e inoculare le ferite con biofilm preformati bioluminescente di p. aeruginosa e condurre Biofotonico monitoraggio dell’infezione utilizzando un in vivo imaging system. Esso offre una diretta, veloce, in situ, un processo non invasivo e quantitativo per valutare i biofilm nelle ferite croniche e permette inoltre, per ulteriori analisi come formazione immagine microscopica della guarigione ferite, intermittente del sangue per misurazioni di citochina e raccolta di tessuto terminale per istologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un nuovo modello murino per lo studio dei biofilm nelle ferite croniche diabetiche che ha molti vantaggi per creare un modello riproducibile, traducibile e flessibile.
La prima innovazione è l’uso di topi glabri. Altri modelli del mouse sono stati sviluppati per studiare diabetica ferita cronica guarigione10,11, ma tutti hanno fatto affidamento sull’uso dei topi dai capelli che richiedono la rimozione della pelliccia d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare l’American Diabetes Association per sostenere questo lavoro (Grant # #7-13-BS-180), la struttura di supporto Michigan State University ricerca tecnologia per fornire formazione e accesso a in vivo imaging sistema e il Michigan State University investigativo istopatologia Lab per l’elaborazione le biopsie del mouse per esame istopatologico.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
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