라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링
Summary
여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.
Abstract
당뇨병 환자, 특히 만성 상처에 구조적된 biofilms 박테리아의 존재는 상처 치유 및 해상도 방지 하기 위해 생각 된다. 만성 마우스 상처 모델 미생물와 호스트 간의 기본 상호 작용 이해에 사용 되었습니다. 최신 개발 모델 머리 동물의 사용 및 실행 가능한 박테리아의 결정에 대 한 상처 조직의 터미널 컬렉션에 의존 합니다. 이러한 모델 인 사이트를 얻고,이 실험적인 절차 필요 동물의 많은 수 및 샘플링 시간이 소모 되는 중요 한 동안. 우리는 만성 상처에 biofilm 진행을 평가 하기 위해 몇 가지 최적의 혁신을 통합 하는 소설 murine 모델 개발: 한) 털 쥐, 머리 제거;에 대 한 필요성을 제거 사용 b) 지 속성의 즉각적인 평가 호스트;에이 커뮤니티의 효과 대 한 수 있도록 상처에 미리 형성 된 biofilms 적용 c) 녹 농 균, 따라서 연구 당 필요한 동물의 수를 줄이고 감염의 실시간 감시를 허용의 유전자 조작된 발광 변형에 의해 빛 생산 측정 모니터링 biofilm 진행 합니다. 이 모델에서 단일 전체 깊이 상처는 STZ 유도 당뇨병 털 쥐의 뒷면에 생산과 P. 농 균 발광 스트레인 젠 41의 biofilms와 주사. 상처에서 광 출력을 vivo에서 이미징 시스템, vivo에서 그리고 제자리에서 빠른 biofilm 시각화 및 상처 내 biofilm 박테리아의 지역화에 대 한 허용에 매일 기록 됩니다. 이 새로운 메서드는 유연한 유전자 조작된 종 등 여러 종 biofilms, 다른 미생물을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 항균 성 폐색 드레싱을 포함 한 안티 biofilm 전략 테스트에 특별 한 가치가 있을 수 있습니다.
Introduction
Biofilms 만성 상처1의 불 쌍 한 해상도 대 한 기여 요인으로 강조 된 고분자 물질의 매트릭스에 포함 된 미생물의 복잡 한 지역 사회는. 이 매우 조직적이 고 지속적인 미생물 인구의 연구는 특히 당뇨병 환자는 사지 및 변경 된 주변 감각 메커니즘에 냉 들 키 지 않고 병 변2이어질 중요 합니다. 미국에서는, 그것은 당뇨병 환자의 15% 그들의 생활의 과정 동안 적어도 하나의 궤를 개발할 것입니다 추정. 이 치료3,4, 약 28 십억 달러의 경제 비용 immensurable 정서적 및 사회적 부담을 언급 하지 않기 위하여 변환 됩니다. 상처 침대와 이러한 biofilms 치유 행사에 미칠 영향에 유지 하기 위해 미생물 커뮤니티를 허용 하는 요소를 이해 하는 것은 영향을 받는 환자에 대 한 더 나은 관리를 운전 하 고 새로운 치료 방법의 개발을 추진 하는 것이 필수적. 따라서, 재현할 수 및 번역 vivo에서 박테리아-호스트 상호 작용을 탐구에 대 한 모델의 설립은 최고 이다.
Murine 모델 biofilms 만성 상처에의 영향을 공부를 성공적으로 개발 되었습니다. 그러나이 모델,, 종종 머리 종 그리고 활용 biofilm 정리 삭제 조직의 희생된 동물, 시간이 소모 및 비용이 많이 드는 그들을 만들기에서 실행 가능한 박테리아 세포에 대 한 판 수에 의해 평가.
Biophotonic 대안 평가 감염 동물의 끝점 샘플링을 Contag 외에의해 처음 제안 했다. (1995) 5 , constitutively 발광 살 모 넬 라 typhimurium 항생제 치료 효능 측정 하에서 발광을 캡처하는 방법 개발. 생물 발광-발광 박테리아를 활용 하는 다른 연구 뒤. 예를 들어 Rochetta은 외. (2001 년) 6 발광 한 강화 전 하 결합 소자를 사용 하 여 측정 하 여 대장균 허벅지 감염 마우스에서 공부 하는 감염 모델 검증 및 나중에, Kadurugamuwa 외. (2003) 7 쥐에서 카 테 터 상처 모델에서 여러 가지 항생제의 효능을 조사 하기 위해 포도 상 구 균 의 설계 긴장의 방출 광자의 이용을 했다.
여기 특징 방법 선물 털이 없는 쥐에 있는 당뇨병을 유도, 생산 및 상처와 미리 형성한 발광 biofilms P. 녹 농 균 의 접종 및 biophotonic 감염의 모니터링을 실시 하는 간단한 프로토콜 사용 하는 비보에 이미징 시스템. 그것은 제공 하는 직접, 급속, 제자리에서비-침략 적, 양적 프로세스 biofilms 만성 상처에 평가 하 고 현미경 이미징 치유의 상처, 간헐적인 혈액 컬렉션에 대 한와 같은 또한 추가 분석에 대 한 수 cytokine 측정, 그리고 조직학에 대 한 터미널 조직 컬렉션.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기는 재현, 번역, 그리고 유연한 모델을 만드는 많은 이점이 당뇨 만성 상처에 biofilms의 연구에 대 한 새로운 마우스 모델에 설명 합니다.
첫 번째 혁신은 털이 없는 쥐의 사용 이다. 모든 왁 싱 또는 머리 클리핑 함께 포함 하는 프로세스에 의해 모피의 제거를 요구 하는 발 마우스의 사용에 의존 해야 하지만 다른 마우스 모델 당뇨병 만성 상처 치유10,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자가이 작품 (그랜트 # #7-13-학사-180), 미시간 주립 대학 연구 기술 지원 시설 교육 및는 vivo에서 이미징 시스템에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 지원에 대 한 미국 당뇨병 협회를 감사 하 고 싶습니다 그리고 미시간 주립 대학 조사 Histopathology 연구소 histopathological 시험에 대 한 마우스 biopsies 처리.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
