Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética
Summary
Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.
Abstract
A presença de bactérias como biofilmes estruturadas em feridas crônicas, especialmente em pacientes diabéticos, é pensada para evitar a cicatrização e resolução. Modelos de feridas crónicas do mouse têm sido utilizados para entender as interações subjacentes entre os microrganismos e o hospedeiro. Os modelos desenvolvidos até à data dependem terminal coleção de tecido da ferida para determinação de bactérias viáveis e a utilização de animais de pelo. Enquanto uma visão significativa tem sido adquirida com estes modelos, este procedimento experimental requer um grande número de animais e amostragem é demorada. Nós desenvolvemos um novo modelo murino que incorpora várias inovações ideais para avaliar a progressão do biofilme em feridas crônicas: uma) que utiliza camundongos sem pelos, eliminando a necessidade de remoção do cabelo; b) pré-formado biofilmes se aplica para as feridas que permite a avaliação imediata de persistência e o efeito destas comunidades no host; c) monitora a progressão do biofilme por quantificar a produção de luz por uma cepa bioluminescente geneticamente modificada de Pseudomonas aeruginosa, permitindo o monitoramento em tempo real da infecção, reduzindo o número de animais necessários por estudo. Neste modelo, uma única ferida cheia-profundidade é produzida na parte de trás da STZ-induzida ratos diabéticos sem pelos e inoculada com biofilmes da estirpe bioluminescente Xen 41 p. aeruginosa . Saída de luz das feridas é registrada diariamente em um na vivo sistema de imagem, permitindo a visualização de biofilme rápida in vivo e in situ e localização de bactérias do biofilme dentro as feridas. Este novo método é flexível, pois pode ser usado para estudar outros microorganismos, incluindo espécies geneticamente modificadas e biofilmes de várias espécies e podem ser de especial valor em teste antibiofilme estratégias incluindo antimicrobianos pensos oclusivos.
Introduction
Biofilmes são comunidades complexas de microorganismos incorporados numa matriz de substâncias poliméricas que destacaram-se como um fator que contribui para a resolução do pobre de feridas crónicas1. O estudo dessas populações microbianas altamente organizado, persistente é particularmente importante para pacientes diabéticos, onde a má circulação em membros e mecanismos sensoriais periféricos alterados levar a lesões detectadas2. Nos Estados Unidos, estima-se que 15% dos pacientes diabéticos desenvolverão pelo menos uma úlcera no decorrer de suas vidas. Isso se traduz em uma despesa econômica de cerca de 28 bilhões de dólares no tratamento3,4, sem mencionar a carga emocional e social imensurável. Compreender os fatores que permitem que comunidades microbianas persistir no leito da ferida e o impacto que estes biofilmes nos eventos curativas é imperativo conduzir melhor cuidados para pacientes afetados e impulsionar o desenvolvimento de novas abordagens de tratamento. Portanto, o estabelecimento de modelos reprodutíveis e traduzíveis em vivo para explorar interações bacterianas-host é primordial.
Murino modelos foram desenvolvidos com sucesso para estudar o impacto de biofilmes em feridas crônicas. Estes modelos, no entanto, muitas vezes utilizam espécies de cabelos e avaliar afastamento de biofilme por placa contagens de células bacterianas viáveis do tecido extirpado de animais sacrificados, tornando-os, demorada e dispendiosa.
Uma alternativa de biophotonic para a amostragem de ponto de extremidade de animais na avaliação de infecção foi proposta por Contag et al. (1995) 5 , quem desenvolveu um método para capturar a luminescência de constitutivamente bioluminescentes Salmonella typhimurium para medir a eficácia do tratamento com antibióticos. Outros estudos, aproveitando-se das bactérias emitem bioluminescência seguido. Por exemplo, Rochetta et al. (2001) 6 validado um modelo de infecção para estudar infecções de coxa de Escherichia coli em camundongos através da medição da luminescência usando um intensificação dispositivo de carga acoplada e mais tarde, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 se aproveitou do fotão emitindo Propriedades de uma engenharia cepa de Staphylococcus aureus para investigar a eficácia de vários antibióticos em um cateter modelo de ferida em ratos.
O método caracterizado aqui apresenta um protocolo simples para induzir diabetes em ratos sem pelos, produzir e inocular as feridas com biofilmes bioluminescentes pré-formado de p. aeruginosa e realizar a biophotonic monitoramento da infecção usando um na vivo sistema de imagem. Ele oferece uma direta, rápida, em situ, processo invasivo e quantitativo para avaliar biofilmes em feridas crônicas e além disso, permite análises adicionais tais como imagem microscópica da cicatrização de feridas, coleta de sangue para medições de citocinas e coleção de terminal de tecidos para a histologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um novo modelo de mouse para o estudo de biofilmes em feridas diabéticas crônicas que tem muitas vantagens para criar um modelo reproduzível, traduzível e flexível.
A primeira inovação é o uso de camundongos sem pelos. Outros modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar diabética ferida crônica cura10,11, mas todos têm contado com o uso de ratos de cabelos que requerem a remoção de pelo por processos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a associação americana de Diabetes para apoiar este trabalho (Grant # #7-13-BS-180), instalação suporte de Michigan estado Universidade pesquisa tecnologia para fornecer treinamento e acesso à na vivo sistema de imagem e o Michigan University investigativo histopatologia laboratório estadual para o processamento de biópsias para exame histopatológico do mouse.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
