Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

Summary

Här beskriver vi en roman diabetiker murina modell utnyttja hårlösa möss för realtid, icke-invasiv, övervakning av biofilm sårinfektioner av självlysande Pseudomonas aeruginosa. Denna metod kan anpassas till utvärdera infektion i andra bakteriearter och genetiskt modifierade mikroorganismer, inklusive flera arter biofilmer, och testa effekten av antimikrobiella strategier.

Abstract

Förekomst av bakterier som strukturerade biofilmer i kroniska sår, särskilt hos patienter med diabetes, är tänkt att förhindra sårläkning och upplösning. Kroniska sår musmodeller har använts att förstå underliggande samspelet mellan mikroorganismer och värden. De modeller som utvecklats hittills är beroende av användningen av haired djur och terminal samling av såret vävnad för bestämning av livskraftiga bakterier. Medan betydande insikt har vunnits med dessa modeller, denna experimentella förfarandet kräver ett stort antal djur och provtagning är tidskrävande. Vi har utvecklat en roman murina modell som innefattar flera optimala innovationer för att utvärdera biofilm progression i kroniska sår: en) använder det hårlösa möss, vilket eliminerar behovet av hårborttagning; (b) gäller förformad biofilmer de sår som möjliggör omedelbar utvärdering av beständighet och effekten av dessa samhällen på värd. (c) övervakar biofilm progression av kvantifiering lätt produktion av en genetiskt modifierade självlysande stam av Pseudomonas aeruginosa, möjliggör realtidsövervakning av infektionen vilket minskar antalet djur som krävs per studie. I denna modell, ett enda full-djup sår produceras på baksidan av STZ-inducerad diabetes hårlösa möss och inokuleras med biofilmer av P. aeruginosa självlysande stammen Xen 41. Ljusflöde från såren registreras dagligen i en in-vivo imaging system, vilket möjliggör i vivo och i situ snabba biofilm visualisering och lokalisering av biofilm bakterier i såren. Denna nya metod är flexibel eftersom den kan användas för att studera andra mikroorganismer, inklusive genetiskt modifierade arter och flera arter biofilmer, och kan vara av speciellt värde i anti-biofilm testningsstrategier inklusive antimikrobiella ocklusionsförband.

Introduction

Biofilmer är komplexa samhällen av mikroorganismer inbäddat i en matris av Polymera substanser som har lyfts fram som en bidragande faktor för kroniska sår¹dålig upplösning. Studien av dessa mycket organiserade, ihållande mikrobiella populationer är särskilt viktigt för patienter med diabetes där dålig cirkulation på armar och ben och förändrad perifera sensoriska mekanismer leder till oupptäckta lesioner². I Förenta staterna uppskattas det att 15% av patienter med diabetes kommer att utveckla minst ett sår under sina liv. Detta innebär att en ekonomisk förbrukning av omkring 28 miljarder dollar i behandling^3,4, för att inte nämna de immensurable känslomässiga och sociala påfrestningarna. Förstå de faktorer som gör att mikrobiella samhällen att kvarstå i såret sängen och den inverkan som dessa biofilmer har i helande händelserna är absolut nödvändigt att driva bättre vård för drabbade patienter och driva utvecklingen av nya behandlingsmetoder. Inrättandet av reproducerbara och översättningsbara i vivo modeller för att utforska bakteriell-host interaktioner är därför avgörande.

Murina modeller har utvecklats framgångsrikt för att studera effekterna av biofilmer i kroniska sår. Dessa modeller, men ofta utnyttja haired arter och utvärdera biofilm clearance av plattan räknas för livskraftiga bakterieceller exciderad vävnad från offrade djur, vilket gör dem tidskrävande och kostsamma.

En biophotonic alternativ till slutpunkten provtagning av djur i utvärdera infektion föreslogs först av Contag et al. (1995) ^{5 ,} som utvecklat en metod att fånga luminiscens från konstitutivt självlysande Salmonella typhimurium att mäta antibiotikabehandling effekt. Andra studier utnyttjar Mareld-avger bakterier följt. Exempelvis Rochetta et al. (2001) ⁶ valideras en infektion modell för att studera Escherichia coli låret infektioner hos möss genom att mäta luminescence med en intensifierad kostnad – tillsammans enhet och senare, Kadurugamuwa et al. (2003) ⁷ drog fördel av fotonen avger egenskaperna för en konstruerad stammar av Staphylococcus aureus att undersöka effekten av flera antibiotika i katetern såret modell hos möss.

Metoden kännetecknas här presenterar ett enkelt protokoll för att inducera diabetes hos hårlösa möss, producera och Inokulera sår med förformad självlysande biofilmer av P. aeruginosa, och genomföra biophotonic övervakning av infektionen använda en in-vivo imaging system. Det erbjuder en direkt, snabb, i situ, icke-invasiv och kvantitativ process för att utvärdera biofilmer i kroniska sår och dessutom möjliggör ytterligare analys såsom mikroskopbilder av läka sår, intermittent blodinsamling för cytokin mätningar och terminal vävnad insamling för histologi.

Protocol

djurförsök godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av Michigan State University. 1. beredning av ocklusionsförband och silikon distanser skär den transparenta täckförbandet att göra rutor ca 1 cm x 1 cm med en sax. Skär 10 mm cirklar på en 0,5 mm tjockt silikon ark med ett 10 mm biopsi punch. Center en 5 mm biopsi punch i mitten av de 10 mm cirkeln och tryck ordentligt för att skapa ett hål att bilda en " munk "-som skiva…

Representative Results

Vid utvecklingen av denna nya modell har observerat vi många fördelar i att utnyttja hårlösa SKH-1 över C57BL/6J möss, som vi har använt tidigare. Djur som utsätts för STZ injektioner normalt upplever gradvis viktminskning med uppkomsten av diabetes; dock i såret bedrivs läka experiment tidigare av våra laboratorier reproducera den modell som presenteras av Dunn et al. (2012) 9 använda C57BL/6J, drastiska viktminskning observerades (<strong cl…

Discussion

Här beskriver vi en ny musmodell för studien av biofilmer i diabetiska kroniska sår som har många fördelar med att skapa en reproducerbar, översättningsbara och flexibel modell.

Den första nyheten är användningen av hårlösa möss. Andra musmodeller har utvecklats för att studera diabetiker kronisk sårläkning^10,11, men alla har förlitat sig på användningen av haired möss som kräver avlägsnande av päls av processer …

Materials

Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner