Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların
Summary
Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.
Abstract
Bakteri varlığı olarak yapılandırılmış biyofilmler özellikle diyabetik hastalarda kronik yaralarda yara iyileşmesi ve çözünürlük önlemek düşünülmektedir. Kronik fare yaralar modelleri mikroorganizmalar ile ana bilgisayar arasındaki temel etkileşimleri anlamak için kullanılmaktadır. Bugüne kadar geliştirilen modelleri tüylü hayvanlar kullanımı ve uygun bakteri tespiti için yara dokusunun terminal koleksiyonu güveniyor. Bu modellerde önemli anlayış kazanmıştır, bu deneysel bir işlem çok sayıda hayvan gerektirir ve örnekleme zaman alıcıdır. Kronik yaralarda biyofilm ilerlemeyi değerlendirmek için birçok en iyi yenilik içermektedir roman bir fare modeli geliştirdik: bir) tüysüz fareler, epilasyon; ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanır b) önceden biçimlendirilmiş biyofilmler sunan sebat hemen değerlendirilmesi ve bu toplulukların ana bilgisayar üzerindeki etkisini yaralar için geçerlidir; c) biyofilm ilerleme Pseudomonas aeruginosaböylece hayvan çalışma gerekli sayısını azaltarak enfeksiyon gerçek zamanlı izleme sağlayan, bir genetik kollarındaki suşu tarafından ışık üretim miktarının tarafından izler. Bu modelde, tek bir tam-derinlik yara STZ-indüklenen diyabetik tüysüz fareler arkasında üretilen ve P. aeruginosa kollarındaki yük Xen 41 biyofilmler ile aşılanmış. Yaraları hafif çıktı günlük görüntüleme sistemi, in vivo ve in situ hızlı biyofilm görselleştirme ve yerelleştirme biyofilm bakteri içinde yaralar için izin bir vivo kaydedilir. Diğer mikroorganizmaların genetik türler ve çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere, çalışma için kullanılan ve test anti-biyofilm stratejileri antimikrobiyal tıkayıcı sosları da dahil olmak üzere özel değeri olabilir roman bu yöntem esnektir.
Introduction
Biyofilmler kronik yaralar1zavallı çözümlenmesi için bir faktör olarak vurgulanmış polimer maddelerin bir matris gömülü mikroorganizmaların karmaşık toplulukları bulunmaktadır. Bu son derece organize, kalıcı mikrobiyal nüfus özellikle bacaklarda ve değiştirilmiş çevresel duyusal mekanizmalar zayıf kan dolaşımı undetected lezyonlar2‘ ye nereye Diyabetik hastalar için önemli bir çalışmadır. Amerika Birleşik Devletleri’nde bu diyabetik hastaların % 15 hayatları boyunca en az bir ülser gelişecektir tahmin edilmektedir. Bu tedavi3,4, 28 milyar dolar civarında bir ekonomik harcama immensurable duygusal ve sosyal yükünü saymıyorum çevirir. Mikrobiyal topluluklar yara yatak ve şifa olaylarda bu biyofilmler etkisi kalıcı olması izin faktörleri anlamak daha iyi bakımı etkilenen hastalar için sürücü ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi itmek için zorunludur. Bu nedenle, bakteriyel konak etkileşimleri keşfetmek için tekrarlanabilir ve çevrilebilir vivo içinde modeller kurulması her şeyden önemlidir.
Fare modelleri başarıyla biyofilmler kronik yaralarda etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu modeller ancak, sık sık saçlı tür kullanmak ve bakteriyel hücrelerin onları zaman alıcı ve pahalı hale kurban hayvanlardan çıkarılan doku için plaka sayar tarafından biyofilm izni değerlendirmek.
Bitiş noktası örnekleme enfeksiyon değerlendirilmesinde hayvanların bir biophotonic alternatif ilk Contag ve arktarafından önerilmiş. (1995) 5 , kim ışıldama antibiyotik tedavisi etkinliği ölçmek için yapısal kollarındaki Salmonella typhimurium sayfasından yakalamak için bir yöntem geliştirdi. Bioluminescence verilirken bakteri yararlanarak diğer çalışmalar izledi. Örneğin, Rochetta ve ark. (2001) 6 doğrulanmış yoğun bir şarj kuplajlı cihaz kullanarak ışıldama ölçerek Escherichia coli uyluk enfeksiyonlar farelerde çalışmaya bir enfeksiyon modeli ve daha sonra Kadurugamuwa ve ark. (2003) 7 farelerde bir kateter yara modelinde çeşitli antibiyotiklerin etkinliğini araştırmak için Staphylococcus aureus mühendislik bir tür özelliklerini yayan foton kullandı.
Burada karakterize yöntemini diyabet tüysüz farelerde ikna etmek, üretmek ve P. aeruginosa, önceden biçimlendirilmiş kollarındaki biyofilmler yaralarıyla aşılamak ve biophotonic enfeksiyon kontrolü yapmak için basit bir protokol sunar görüntüleme sistemi bir vivo içinde kullanma. O teklif etmek yolu tarif etmek, hızlı, in situ, biyofilmler kronik yaralarda değerlendirmek için non-invaziv ve nicel süreç ve yara iyileşme mikroskobik görüntüleme gibi aralıklı kan toplama için buna ek olarak, ek analiz için sağlar sitokin ölçümleri ve Histoloji terminal dokusu toplamalarında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir tekrarlanabilir, çevrilebilir ve esnek model oluşturmak için pek çok avantajı vardır biyofilmler diyabetik kronik yaralarda çalışma için yeni bir fare modeli açıklar.
İlk yenilik tüysüz fareler kullanmaktır. Diğer fare modelleri10,11şifa diyabetik kronik yara incelemek için geliştirilmiştir, ama tüm ağda veya saç kırpma ile birlikte ilgili işlemler tarafından kürk kaldırılmasını gerektiren sa?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Amerikan Diyabet Derneği bu eser (Grant # #7-13-BS-180), Devlet Üniversitesi Araştırma teknoloji Michigan Destek Merkezi eğitim ve görüntüleme sistemi vivo içinde erişim sağlamak için destek için teşekkür etmek istiyorum ve Michigan Eyalet Üniversitesi araştırmacı histopatoloji histopatolojik inceleme için fare biyopsileri işlemek için laboratuvarı.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
