우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 분자 위치 결정 현미경을 이용한 이질적인 세포 구조의 영상화는 부적절한 위치 파악 정밀도와 다중화 능력으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 형광 나노 다이아몬드 기준 마커를 사용하여 단일 분자 현지화 현미경에서 높은 정밀도를 얻기 위해 필요한 드리프트 보정 및 정렬 절차를 설명합니다. 또한, 다중 항체 전략 인 madSTORM은 여러 분자가 형광 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 이용하여 동일한 세포에서 표적화되는 것으로 기술된다. madSTORM은 활성화 된 T 세포에서 T 세포 수용체 마이크로 클러스터라고 불리는 막 결합 다중 단백질 구조 내 다른 구성 요소의 위치를 시각화합니다. 또한, 다중 단백질 구조의 시각화를위한 일반적인 도구로서 madSTORM의 응용이 논의되었다.
서론
광학 현미경 (~ 200 nm)의 회절 한계를 극복하기 위해 다양한 초고 해상도 현미경 기술이 개발되었습니다. 이 중에는 PALM (optical-activation localization microscopy)과 STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)이 포함 된 단일 분자 위치 확인 현미경 (SMLM)이라는 기술 범주가 있습니다. SMLM 기술은 on (형광) 상태와 off (dark / photo-switched) 상태 사이에서 전환 할 수있는 형광체의 사용을 공유하므로 단일 분자 1 , 2 , 3 의 형광을 연속적으로 위치시킬 수 있습니다.
시중에서 판매되는 염료 및 현미경과의 호환성으로 인해 직접 STORM (dSTORM)은 널리 채택 된 SMLM 기술입니다. dSTORM은 회절의 중심 계산시 불확실성으로 정의되는 ~ 10 nm의 위치 정밀도를 일상적으로 달성 할 수 있습니다이온 제한점 확산 기능 (PSF). 그러나, 국소화 알고리즘 5 ,
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프로토콜
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성입니다. 엔지니어링 제어 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험복, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발)의 사용을 포함하여 프로토콜을 수행 할 때 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오.
1. 활성화 된 T 세포의 멀티플렉싱 이미징
- Alexa 647 항체 라벨링 키트를 사용하여 항체를 Alexa-647 (A647) 염료와 직접 결합시킵니다. 제조자가 제공 한 라벨링 프로토콜을 따른다.
참고 :이 단계 전에 항체 라벨링 효율을 높이려면 1x PBS에서 항체 용액 투석을 권합니다. - 20,800 rcf에서 5 분 동안 항체를 표지하고 상등액을 수집하여 응집 된 항체를 제거합니다.
- 형광 나노 다이아몬드 코팅 커버 슬립 준비
- 0.01 % Poly-L-Lysine (PLL) 250 μL와 함께 8- 웰 coverslip 챔버 (시약 / 재료 목록 참조)를 15 분 동안 코팅하고, 대기음을 내고 65 분 동안 30 분 동안 건조시킵니다. (건조하기 전에 헹구지 마십시오.....
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결과
순차적 인 용리 및 염색 방법은 활성화 된 Jurkat T 세포 ( 그림 1 , 확인 숫자 정렬)에서 마이크로 클러스터 및 기타 구조의 다중화 된 madSTORM 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 각각의 의사 컬러 이미지는 1.1.1에서 1.3.13 단계에서 얻은 madSTORM 이미징의 한 라운드를 나타냅니다. 앞에서 설명한 것처럼, 다중 표적 사이의 혼선을 피하기 위해 이전의 용출되지 않은 항체의 잔류 신호에 대해 시야를 모니터링해야합니다. 더욱이, 용출 효율이 항체 들간에 다양 할 수 있기 때문에, 순차 멀티플렉싱의 순서는 에피토프의 입체적 차단을 최소화하기 위해 가장 좋은 것에서 최악의 용출 항체까지 배열되어야한다. 그림 1 의 최종 madSTORM 이미지는 2 절에서 설명한대로 AFC 및 FND 기준 마커를 사용하여 드리프트 및 정렬을 위해 보정되었습.......
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토론
madSTORM의 순차 멀티플렉싱, 드리프트 보정 및 정렬 절차를 통해 세포 내 이종 구조의 정밀하고 고도로 다중화 된 시각화가 가능합니다. 또한 madSTORM은 색이 다른 STORM의 제한 사항 (예 : 색수차 및 비 원거리 적색 염료 9 , 12의 최적의 광 스위치 / 방출 특성)을 피합니다. 용출 단계가 순차적으로 결합 된 항체로부터 입체감을 현저히 감소 시킴에 따라 madSTORM을 사용하여 이전의 기술 9 , 15 , 21에 의해 달성 된 6-10 회의 다중 이미지를 넘어서 세포 샘플의 반복 이미징을 수행 할 수 있습니다. 또한, 순차적 인 용출 및 염색 단계는 SMLM에 국한되지 않으며 공 초점 현미경, SIM 및 2 광자 현미경과 같은 다른 영.......
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공개 사항
우리는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
STORM 현미경에 대한 액세스를 위해 Xufeng Wu에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 암 연구소와 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 8 웰 커버 슬립 챔버 | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1 % 폴리 -L- 라이신 용액 | 시그마 - 알드리치 | P8920 | |
| NV-100 nm 형광 나노 다이아몬드 | 아다마스 | 레드 FND | |
| 안티 CD3 &엡실론; 항체 | BD Biosciences | 555329 | |
| 소 혈청 알부민, 분획 V | KSE 과학 | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% 파라포름알데히드 | EMS | 15712 | |
| 민물고기 피부의 발암물질 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 항체 라벨링 키트 | Thermo Fisher | A20186 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M7154 | 고독성, 공기에 민감한 |
| 시스테아민 | Sigma-Aldrich | 30070 | 고독성 |
| 시클로옥타테트라엔 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | 고독성, 공기에 민감한 |
| 10x PBS | KD 의학 | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD 의학 | RGF-3385 |
참고문헌
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. ....
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재인쇄 및 허가
