שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג'ל
Summary
במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.
Abstract
ישנן מספר טכניקות שונות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם היתרונות והחסרונות שלהם. הגישה המסורתית, ניתוח הגבלת Telomere (TRF), משתמשת בטכניקת הכלאה של דנ"א לפיה דגימות DNA גנומיות מתעכלות עם אנזימי הגבלה, ומשאירות מאחור את ה- DNA של הטלומרים וחוזרת ל- DNA תת-טלומרי. אלה מופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל, הועברו קרום סינון הכלאה בדיקות oligonucleotide שתייגת עם או chemiluminescence או רדיואקטיביות לדמיין שברי הגבלת הטלומרים. גישה זו, תוך צורך כמות גדולה יותר של DNA מאשר טכניקות אחרות כגון PCR, יכול למדוד את התפלגות אורך הטלומרים של אוכלוסייה של תאים ומאפשר מדידה לידי ביטוי קילובזות מוחלטות. כתב יד זה מדגים תהליך הכלאה DNA שונה לקביעת אורך הטלומרים. הדנ"א הגנומי מעוכל לראשונה עם אנזימי הגבלה (שאינם חותכיםטלומרים) ומופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל. הג'ל מיובש ואז DNA הוא denatured ו הכלאה באתרם כדי בדיקה oligonucleotide radiolabeled. זה הכלאה באתרה נמנע אובדן של הטלומרים DNA ומשפר את עוצמת האות. בעקבות הכלאה, ג 'לים הם צילמו ניצול מסכי זרחן אורך הטלומרים הוא לכמת באמצעות תוכנית גרפים. הליך זה פותח על ידי מעבדות של ד"ר. וודרינג רייט וג 'רי שי באוניברסיטת טקסס דרום מערב 1 , 2 . כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של הליך זה, עם כמה שינויים.
Introduction
Telomeres, הממוקם בקצה של כרומוזומים, הם חוזרים על נוקליאוטידים של רצף TTAGGG (על כרומוזומים אנושיים) אשר ממלאים תפקיד קריטי בהגנה על מידע גנטי סלולרי 3 , 4 , 5 . Telomeres כמה אלפי זוגות בסיס באורך לשמש להגנה על שלמות שאר הכרומוזום במהלך שכפול ה- DNA. שכפול של כרומוזומים אינו מושלם וכתוצאה מכך הקצוות של הכרומוזום לא מועתקים לחלוטין. חוסר יעילות זה בשכפול נקרא "בעיית שכפול הסיום" ומביא לאובדן של חלק חוזר הטלומרים במהלך כל סיבוב של שכפול 6 , 7 . אורך הטלומרים ניתן לשחזר לאחר חלוקת התא על ידי telomerase, אנזים המחליף את רצף הטלומרים לאיבוד 8 , 9 . Telomerase, לעומת זאת, לאהמופעלים ברוב התאים הסומטיים האנושיים וכתוצאה מכך, לאורך זמן, הטלומרים יתקצרו, ובסופו של דבר יוביל לזרימה התאית 10 . בשל קיצור הטלומרים, טלומרים נחשבים ביומרקר של הזדקנות הסיכון למחלות הקשורות לגיל 11 , 12 . בנוסף, אורך הטלומרים יכול להיות מושפע מגורמים גנטיים, סביבתיים וסגנון חיים וגירויים אחרים כגון מתח חמצוני, דבר המעיד על כך שאורך הטלומרים יכול למלא תפקיד כסימן ביולוגי במחקרים טוקסיקולוגיים, אפידמיולוגיים והתנהגותיים 13 , 14 , 15 .
מאמר זה מדגים טכניקה למדידת אורך הטלומרים באמצעות שינוי מגבלה מסוף שונה (TRF) ניתוח מותאם מ Mender ו שי 2 ו Kimura et al. 16 , ודומה להרברט, שי וריגHt 1 ו האוסמן ו Mauck 17 . באופן מסורתי, ניתוח TRF כרוך הליך דרום כתם. כתמי הדרום נחשבים ל"סטנדרט הזהב "ללימוד אורך הטלומרים ומשמשים באופן פעיל לבדיקת אורך הטלומרים של הלייקוציטים במחקרים באפידמיולוגיה 18 . זה ניתוח TRF משתמש בדנ"א גנומי מתעכל משאיר מאחור את החזרות הטלומרים. שברי ה- DNA מופרדים אז על ידי ג'ל אלקטרופורזה, מפוגל ומועבר קרום nitrocellulose. רצפים הטלומרים הם הכלאה כדי בדיקה oligonucleotide הטלומרים. במקום להעביר את הטלומרים מופרדים קרום, טכניקות אחרות TRF להשתמש בטכניקות הכלאה ג'ל עם וללא denaturation של ה- DNA. הכללת denaturation חשוב כאשר שוקלים זיהוי של טלומרים interstitial, אשר דווחו במינים מסוימים 19 . נהלים ללא צעדים denaturing רק לזהות thE חד גדילי דנ"א נטוש ב Telomeres סופני ולא יחברו interstitial הטלומרים sequences 18 .
מלבד ניתוח TRF, ישנן מספר טכניקות אחרות למדידת אורך הטלומרים שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. טכניקת זרימה- FISH יכול למדוד אורך הטלומרים הממוצע של תאים בודדים של סוג תא ייחודי באמצעות cytometry זרימה 16 , 20 . למרות שהוא יכול לתג את הטלומרים במדויק עם בדיקות ספציפיות מאוד ולהפחית את השגיאה האנושית באמצעות אוטומציה, Flow-Fish הוא יקר, פחות יעיל דורש דגימות טריות טכנאי מיומן מאוד, הגבלת יכולתו ללימודי אפידמיולוגיה 16 . בנוסף, שיטה זו אינה אחראית לשינויים אפשריים במספר הכרומוזומים באוכלוסיית התאים. טכניקה נוספת, qPCR, מקובלת באופן נרחב כאמצעי למדידת אורך הטלומרים למחקרים אפידמיולוגיים <suP class = "xref"> 16 בשל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה הדרישה עבור כמויות קטנות של DNA בהשוואה לשיטות אחרות. עם זאת, qPCR יכול רק למדוד תוכן DNA הממוצע הטלומרי יחסית לגן עותק יחיד הוא, ולכן, הערכה עקיפה של אורך הטלומרים הממוצע. כמו כן, היא מניבה מקדם השתנות גבוה במחקרי השוואה, בהשוואה לכתמים דרומיים, המביאים לדיוק מפוקפק 21 .
הליך TRF יש ליקויים משלה כי להגביל את השימוש שלה עבור כמה מחקרים. טכניקות TRF דורשות כמות גדולה של DNA בהשוואה לשיטות אחרות (בין 2 ל -3 מיקרוגרם לכל מדגם). זה מגביל את היישומים של הטכניקה לבדיקת אורך הטלומרים של דגימות קליניות שעבורן ניתן לאסוף דנ"א גנומי מספיק, ואי אפשר להשתמש בהן על דגימות DNA נמוכות. בנוסף, ניתוח TRF הוא יקר ועבודה אינטנסיבית, הדורש 4-5 ימים כדי להניב תוצאות. עם זאת, TRF מניב מקדם נמוך של שונותמתן reproducibility שלה. בעוד פרוטוקול זה שונה מאשר הכתם הדרומי המסורתי (תוך ניצול הכלאה ג'ל באתרה ), שתי טכניקות ביסודו זהה.
הטכניקה המוצגת כאן היא שילוב של כתם דרום הכלאה ג'ל; שיוך שלב denaturing DNA מ כתמי דרום עם הכלאה ב-ג'ל. שילוב זה יש את היתרון הנוסף של שיפור כוח האות בדיקה לעומת הכתם הדרומי יש הניבה באופן עקבי תוצאות לכימות בתוך המעבדה שלנו. בנוסף, השימוש בדיקות רדיואקטיביות ולא בדיקות chemiluminescent התשואות עוצמת האות גבוהה יותר מאפשר הדמיה וכימות עם phosphorimager, מה שהופך את הניתוחים של TRF ידידותי למשתמש.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעקבות אלקטרופורזה, כתם ה- DNA הגנומי גבוה מ -800 bp. זה יכול להתרחש אם אנזימים הגבלה הם פגומים או אם אנזימים נוספים (כמתואר לעיל) נדרשים. הסבר אפשרי נוסף הוא שהחלבון עדיין מחובר לדנ"א. בעת קביעת ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר, יחס 260/280 צריך להיות סביב 1.8. אם יחס זה הוא <1.5,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מאשרים את התמיכה של אוניברסיטת פיטסבורג סרטן המכון Biobehavioral אונקולוגיה משותפת במתקן הנתמך בחלקו על ידי פרס P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
