Påvisning af resterende Donor Erythroid stamceller efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation til patienter med Hemoglobinopathies
Summary
Kvantificering af donor-afledte celler er forpligtet til at overvåge engraftment efter stamcelletransplantation hos patienter med hemoglobinopathies. En kombination af flow flowcytometri-baserede celle sortering, koloni dannelse assay og efterfølgende analyse af korte tandem gentagelser kan bruges til at vurdere spredning og differentiering af stamfaderen i erythroid rum.
Abstract
Tilstedeværelsen af ufuldstændige kimærisme bemærkes, i en stor del af patienterne efter knoglemarvstransplantation for thalassemia større eller seglcelleanæmi. Denne observation har enorme konsekvenser, som efterfølgende terapeutiske immunomodulation strategier kan forbedre kliniske udfald. Konventionelt, bruges polymerase kædereaktion-baseret analyse af korte tandem gentagelser til at identificere kimærisme i donor-stammer blodlegemer. Men denne metode er begrænset til nukleeret celler og kan ikke skelne mellem dissocierede encellede lineages. Vi anvendes analyse af korte tandem gentagelser til flow cytometric-sorteret hæmatopoietisk stamceller og sammenlignede dette med analyse af korte tandem gentagelser fremstillet af udvalgte burst-dannende enhed – erythroid kolonier, både indsamlet fra knoglen marv. Med denne metode er vi i stand til at demonstrere forskellige spredning og differentiering af donor celler i erythroid rum. Denne teknik er berettiget til at fuldføre nuværende overvågning af kimærisme i stamcelletransplantation indstilling og dermed kan blive anvendt i fremtidige kliniske studier, forskning i stamceller og design af gene therapy forsøg.
Introduction
Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) er den eneste tilgængelige helbredende tilgang til en række medfødte genetiske sygdomme af hæmatopoietisk systemet, at opnå sygdomsfri overlevelsesrater på mere end 90%, for ellers stærkt kompromitteret og begrænset levetid patienter1. Effekten af dette vigtigt terapeutisk redskab er optimeret ved at begrænse toksiciteten af pre- og efter transplantationen regimer2, men også af interventionerne sigter mod at opretholde stabile graft funktion, som skal være talbestemt ved nøje overvågning af donor-afledte celler3,4,5.
I almindelighed, indebærer komplet kimærisme (CC) den samlede udskiftning af lymphohematopoietic til kabinen af donor-afledte celler, hvorimod udtrykket blandet kimærisme (MC) bruges når donor – og modtager-afledte celler findes samtidig i forskellige proportioner. Split kimærisme (SC) betegner sameksistensen af blandet kimærisme observeret i encellede slægter, som i erythroid rum. Hurtig bestemmelse af kimærisme status efter HSCT er kritisk, da det kan hjælpe med at identificere patienter modtagelige for sygdom tilbagefald og indlede efterfølgende immunmodulerende strategier, som donor lymfocytter infusioner eller reduktion af immunosuppressive behandlingsformer6.
Flere metoder er blevet udviklet for at overvåge engraftment efter HSCT. Isotyping af immunoglobuliner og analyse af cytogenetisk har ringe følsomhed og er begrænsede i deres evne til at detektere polymorfi7,8. Indførelsen af fluorescerende i situ hybridisering (FISH) kan øge følsomheden i kimærisme overvågning efter HSCT, men er begrænset til sex-uoverensstemmende allografts9. I øjeblikket, polymerase kædereaktion (PCR) er den mest udbredte metode til at registrere kimærisme og er baseret på konventionelle Agarosen-acrylamid gelelektroforese af variable number tandem gentagelser (VNTRs) eller korte tandem gentager (mistænkelige). Rutinemæssigt anvendes er kvantitativ PCR købedygtig opdager en meget lille del af de resterende donor celler efter HSCT. De store begrænsning af undersøgelserne hidtil er at MC opdagelse er næsten udelukkende begrænset til tilstedeværelsen af nukleeret celler i stedet for modne erythrocytter, nemlig celler at funktionelt afgørende for patienter påvirkes af hemoglobinopathies. Hos patienter med forskellige blodtyper er det værd at huske at cytofluorometric analyse er købedygtig identificere kimærisme i røde blodlegemer ved hjælp af monoklonale antistoffer rettet mod erytrocyt antigener ABO og C, c, D, E og e10 , 11. en anderledes, men meget interessant middel til vurdering af kimærisme i erythroid afstamning er kombinationen af flow cytometric sortering af erythroid ophav og udsnit af forskellige erythroid stamfader ved dyrkning i clonogenic assays, efterfulgt af en analyse af STR12. Denne tilgang er i stand til at kvantificere relative proportioner af donor-versus-modtageren kimærisme i erythroid rum og kan udnyttes i strategien for at opretholde knoglemarv graft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med den aktuelle undersøgelse er at give publikum en kombination af to tilgange til analyse af donor/recipient kimærisme i erythroid progenitorceller efter HSCT hos patienter behandlet for hemoglobinopathies: 1.) Fluorescens-aktiveret celle sortering af hæmatopoietisk stamceller i knoglemarven prøver efterfulgt af en analyse af korte tandem gentagelser og 2.) kolonidannende enhed vokser af knoglemarv celler, klassificering af kolonier i forskellige stamfader typer efterfulgt af en analyse af korte tandem ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
