Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën
Summary
Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.
Abstract
De aanwezigheid van onvolledige chimerism is in een groot deel van de patiënten na beenmergtransplantatie voor thalassemie grote of sikkelcelziekte hebt genoteerd. Deze constatering heeft enorme implicaties, als latere therapeutische immunomodulatie strategieën klinische resultaten kunnen verbeteren. Conventioneel, wordt polymerase kettingreactie gebaseerde analyse van korte tandem herhalingen gebruikt voor het identificeren van chimerism in donor-afgeleide cellen van het bloed. Echter, deze methode is beperkt tot genucleëerde cellen en geen onderscheid maken tussen gedissocieerde eencellige geslachten. We toegepast van de analyse van korte tandem herhalingen te stromen van hematopoïetische voorlopercellen cytometrische-gesorteerd en vergeleken dit met de analyse van korte tandem herhalingen verkregen uit geselecteerde burst-vormende eenheid – erythroid kolonies, beide verzameld uit het bot beenmerg. Met deze methode zijn wij in staat om aan te tonen van de verschillende proliferatie en differentiatie van cellen van de donor in het compartiment van de erythroid. Deze techniek in aanmerking komt voor het voltooien van de huidige monitoring van chimerism in de stamcel transplantatie instellen en dus kan worden toegepast in de toekomst klinische studies, stamcelonderzoek en het ontwerp van gene therapie proeven.
Introduction
Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) is de enige beschikbare curatieve aanpak voor een verscheidenheid van aangeboren erfelijke aandoeningen van het hematopoietische systeem, ziektevrije overleving tarieven van meer dan 90% bereiken, want anders zeer aangetast en beperkte levensduur patiënten1. De werkzaamheid van dit belangrijk therapeutisch instrument is geoptimaliseerd door het beperken van de toxiciteit van pre- en na transplantatie regimes2, maar ook door interventies gericht op het behoud van stabiele graft functie, die wordt gekwantificeerd door het nauwe toezicht op donor-afgeleide cellen3,4,5.
In het algemeen, impliceert volledige chimerism (CC) de totale vervanging van het compartiment van de lymphohematopoietic door donor-afgeleide cellen, overwegende dat de term gemengd chimerism (MC) wordt gebruikt als donor – en ontvanger-afgeleide cellen tegelijk aanwezig in verschillende zijn verhoudingen. Split chimerism (SC) duidt de coëxistentie van gemengde chimerism waargenomen in eencellige lineages, zoals in het compartiment van de erythroid. Snelle bepaling van de status van de chimerism na HSCT is van cruciaal belang, aangezien het kan helpen identificeren van patiënten vatbaar voor ziekte herval en starten van de daaropvolgende immunomodulerende strategieën, zoals donor lymfocyt infusies of vermindering van immunosuppressieve therapieën6.
Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het toezicht op engraftment na HSCT. Isotyping van immunoglobulinen en analyse van cytogenetica hebben slechte gevoeligheid en zijn beperkt in hun vermogen om het detecteren van polymorfisme7,8. De invoering van fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) gevoeligheid in chimerism monitoring na HSCT kan verbeteren, maar is beperkt tot seks-mismatched allografts9. Op dit moment de Kettingreactie van de polymerase (PCR) is de meest voorkomende methode gebruikt voor het opsporen van chimerism en is gebaseerd op de Elektroforese van het gel van de conventionele agarose-acrylamide variabele nummer tandem herhalingen (VNTRs) of korte tandem herhaalt (STRs). Routinematig gebruikt is kwantitatieve PCR kundig voor speurder een zeer klein deel van de resterende donor cellen na HSCT. De belangrijkste beperking van de studies tot nu toe is dat MC detection is vrijwel uitsluitend beperkt tot de aanwezigheid van genucleëerde cellen, in plaats van rijpe erytrocyten, namelijk cellen dat functioneel cruciaal voor patiënten ondervinden Hemoglobinopathieën. Bij patiënten met verschillende bloedgroepen is het goed te beseffen dat cytofluorometric analyse vermag chimerism in rode bloedcellen te identificeren met behulp van monoklonale antilichamen gericht op de erytrocyt antigenen ABO en C, c, D, E en e10 , 11. een verschillende, maar zeer interessant middel voor de beoordeling van de chimerism in het geslacht erythroid is de combinatie van stroom cytometrische sorteert van erythroid voorlopercellen en selectie van verschillende types van erythroid voorlopercellen kweken in clonogenic tests, gevolgd door analyse van STR12. Deze aanpak is kunnen kwantificeren van de relatieve verhoudingen van donor-versus-ontvanger chimerism in het compartiment van de erythroid en kan worden gebruikt in de strategie om te ondersteunen de prothese beenmerg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van de huidige studie is bedoeld als het publiek een combinatie van twee benaderingen voor het analyseren van de chimerism van de donor/ontvanger in erythroid progenitoren HSCT na bij patiënten behandeld voor Hemoglobinopathieën: 1.) fluorescentie-geactiveerde cel sorteren van hematopoietische stamcellen in beenmerg monsters gevolgd door analyse van korte tandem herhalingen en 2.) kolonie-vormende eenheid groeit van beenmergcellen, indeling van de kolonies in verschillende types van voorlopercellen gevolgd doo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
