Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies
Summary
Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.
Abstract
La présence de chimérisme incomplète est notée dans une grande proportion de patients après greffe de moelle osseuse pour la thalassémie ou la drépanocytose. Cette observation a des implications énormes, comme stratégies d’immunomodulation thérapeutique ultérieure peuvent améliorer les résultats cliniques. Conventionnellement, analyse axée sur la réaction en chaîne de la polymérase de séquences répétées en tandem courtes sert à identifier chimérisme dans les cellules de sang provenant de donneurs. Toutefois, cette méthode est limitée aux cellules nucléées et ne peut pas distinguer entre deux lignées unicellulaires dissociées. Nous avons appliqué l’analyse de séquences répétées en tandem courtes à l’écoulement des cellules progénitrices hématopoïétiques triée par cytométrie en flux et comparé cela avec l’analyse de séquences répétées en tandem courte provenant d’unité formant des rafale sélectionnée – colonies érythroïdes, tous deux prélevés dans l’OS moelle osseuse. Avec cette méthode, nous sommes en mesure de démontrer les différente prolifération et la différenciation des cellules du donneur dans le compartiment érythroïde. Cette technique a le droit de compléter la surveillance actuelle de chimérisme dans la greffe de cellules souches définissant et ainsi peut être appliquée à l’avenir les études, de recherche sur les cellules souches et de conception des essais de thérapie génique.
Introduction
La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est l’approche curative disponible uniquement pour une variété de désordres génétiques innées du système hématopoïétique, atteindre des taux de survie sans maladie de plus de 90 % d’ailleurs fortement compromise et durée de vie limitée patients1. L’efficacité de cet outil thérapeutique important a été optimisée en limitant la toxicité de pré- et post transplantation schémas2, mais aussi par des interventions vise à soutenir la fonction du greffon stable, qui est quantifié par un suivi étroit des cellules dérivées donneur3,4,5.
En général, chimérisme complet (CC) implique le remplacement total du compartiment lymphohématopoïétiques de cellules dérivées de donateurs, alors que les expressions diverses de chimérisme (MC) sont utilisée lorsque le donneur et receveur-cellules sont présents simultanément dans divers proportions. Chimérisme Split (SC) désigne la coexistence de chimérisme mixte observée dans des lignées de cellules individuelles, comme dans le compartiment érythroïde. Détermination rapide du statut de chimérisme suite tcsh est critique, car elle peut aider à identifier les patients susceptibles de rechute de la maladie et les stratégies d’initier immunomodulatrices ultérieures, comme donneur lymphocytaire infusions ou réduction des immunosuppresseurs 6de thérapies.
Plusieurs méthodes ont été développées pour le suivi de greffe après tcsh. Isotyping des immunoglobulines et des analyses de cytogénétique ont une sensibilité médiocre et sont limités dans leur capacité à détecter le polymorphisme7,8. L’introduction d’hybridation fluorescente in situ (FISH) peut augmenter la sensibilité à la surveillance de chimérisme après tcsh, mais se limite aux allogreffes sexe-incompatibles,9. Actuellement, réaction en chaîne par polymérase (PCR) est la méthode la plus répandue, utilisée pour détecter le chimérisme et repose classiques d’agarose-acrylamide par électrophorèse sur gel de séquences répétées en tandem nombre variable (SRTNV) ou en tandem courte répétitions (DoD). Régulièrement utilisée PCR quantitative est capable de détecter une proportion très faible de cellules de donneur résiduelle après tcsh. La limitation majeure des études jusqu’à présent est que MC détection est presque exclusivement limitée à la présence de cellules nucléées, plutôt que d’érythrocytes matures, à savoir les cellules qu’est fonctionnellement crucial pour les patients affecté par des hémoglobinopathies. Chez les patients avec différents groupes sanguins, il faut se rappeler que l’analyse donnée est capable d’identifier chimérisme dans les globules rouges en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés vers les antigènes érythrocytaires ABO et C, c, D, E et e10 , 11. un moyen différent, mais très intéressant d’évaluer chimérisme dans la lignée érythroïde est la combinaison de flux par cytométrie en flux, tri des progéniteurs érythroïdes et sélection des divers types de progéniteurs érythroïdes en cultivant dans des essais clonogéniques, suivi par analyse de STR12. Cette approche est en mesure de quantifier les proportions relatives des donateurs-versus-bénéficiaires chimérisme dans le compartiment érythroïde et peut-être être utilisée dans la stratégie pour préserver la greffe de moelle osseuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de la présente étude est de fournir au public une combinaison des deux approches pour analyser chimérisme donneur/receveur en progéniteurs érythroïdes suite tcsh chez les patients traités pour hémoglobinopathies : 1.) activés par fluorescence cellulaire tri des cellules souches hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse suivies d’analyse de séquences répétées en tandem courtes et 2.) unité formant colonie de plus en plus de cellules de moelle osseuse, classification des col…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
