Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías
Summary
Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.
Abstract
La presencia de quimerismo incompleto se observa en una gran proporción de pacientes después de trasplante de médula ósea para la talasemia mayor o enfermedad de células falciformes. Esta observación tiene enormes consecuencias, como estrategias de inmunomodulación terapéutica posterior pueden mejorar el resultado clínico. Convencionalmente, análisis reacción-basado cadena de la polimerasa de repeticiones en tándem cortas se utiliza para identificar el quimerismo en las células sanguíneas derivadas de donantes. Sin embargo, este método está restringido a las células nucleadas y no puede distinguir entre linajes unicelular disociados. Aplicamos el análisis de repeticiones en tándem cortas de células progenitoras hematopoyéticas ordenados por citometría de flujo y esto comparado con el análisis de repeticiones en tándem cortas de ráfaga-formación seleccionada – colonias eritroides, ambos recogidos del hueso médula ósea. Con este método que son capaces de demostrar los diferentes proliferación y diferenciación de células del donante en el compartimiento eritroide. Esta técnica es elegible para completar el seguimiento actual de quimerismo en el trasplante de células madre que se ajuste y por lo tanto puede ser aplicados estudios clínicos en el futuro, la célula de vástago investigación y diseño de ensayos de terapia genética.
Introduction
Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el enfoque curativo sólo está disponible para una variedad de trastornos genéticos innatos del sistema hematopoyético, lograr tasas de supervivencia libre de enfermedad de más del 90% de lo contrario altamente comprometida y vida útil limitada de pacientes1. La eficacia de esta importante herramienta terapéutica ha sido optimizada por limitar la toxicidad de pre- y post-trasplante regímenes2, pero también por las intervenciones encaminadas a mantener la función estable del injerto, que se cuantifica por la vigilancia estrecha de células procedentes de donantes3,4,5.
En general, quimerismo completo (CC) implica la sustitución total del compartimiento del lymphohematopoietic por células derivadas del donante, mientras que el término mezclado chimerism (MC) se utiliza cuando las células derivadas del donante y del receptor están simultáneamente presentes en varios proporciones. Quimerismo dividido (SC) denota la coexistencia del chimerism mezclado observado en linajes unicelular, como en el compartimento eritroide. Determinación rápida del estado de quimerismo después de HSCT es crítica, como puede ayudar a identificar a los pacientes susceptibles de recaída de la enfermedad y estrategias de iniciar posteriores inmunomoduladores, como infusiones de linfocitos de donante o la reducción de inmunosupresores terapias6.
Varios métodos han sido desarrollados para supervisar el engraftment después de HSCT. Isotyping de las inmunoglobulinas y el análisis de citogenética tienen pobre sensibilidad y están limitados en su capacidad para detectar polimorfismo7,8. La introducción de fluorescente en situ del hibridación (pescado) puede mejorar la sensibilidad en el seguimiento de quimerismo después de HSCT, pero se limita a aloinjertos no coinciden el sexo9. Actualmente, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es el método más generalizado para detectar chimerism y está basada en electroforesis del gel de agarosa-acrilamida convencional de repeticiones en tándem número variable (VNTRs) o repeticiones de corto tándem (STRs). Rutinariamente utilizado PCR cuantitativa es capaz de detectar una proporción muy pequeña de células de donantes residual después de HSCT. La limitación principal de los estudios hasta ahora es que MC detección se limita casi exclusivamente a la presencia de células nucleadas, en lugar de eritrocitos maduros, es decir, las células funcionalmente crucial para los pacientes afectado por hemoglobinopatías. En pacientes con grupos sanguíneos diferentes, cabe recordar que el análisis de cytofluorometric es capaz de identificar el quimerismo de células de sangre rojas mediante la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los antígenos de eritrocitos ABO y C, c, D, E y e10 , 11. un medio diferente, pero muy interesante de evaluación de quimerismo en el linaje eritroide es la combinación de flujo cytometric selección de progenitores eritroides y selección de diversos tipos de progenitoras eritroides por cultivo en análisis clonogenic, seguido por el análisis de STR12. Este enfoque es capaz de cuantificar las proporciones relativas de quimerismo de donante y receptor en el compartimiento eritroide y puede ser utilizado en la estrategia para sostener el injerto de médula ósea.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo del actual estudio es proporcionar al público una combinación de dos enfoques para el análisis de quimerismo donante/receptor en progenitores eritroides después de HSCT en pacientes trataron por Hemoglobinopatías: 1.) clasificación celular activado por fluorescencia de células progenitoras hematopoyéticas en muestras de médula ósea seguidas de análisis de repeticiones en tándem cortas y 2.) Unidad Formadora de colonias de crecimiento de las células de la médula ósea, clasificación de las colon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Kinderkrebshilfe arco iris Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
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