Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama
Summary
Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.
Abstract
Eksik chimerism varlığı kemik iliği nakli için büyük talasemi veya orak hücre hastalığı hastaların büyük bir kısmı belirtilmektedir. Sonraki terapötik immunomodulation stratejileri-ebilmek geliştirmek klinik sonuç olarak bu gözlem çok büyük etkileri vardır. Geleneksel, Polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analizini kısa tandem tekrarlar donör kaynaklı kan hücrelerinde chimerism tanımlamak için kullanılır. Ancak, bu yöntem çekirdekli hücrelere sınırlıdır ve Disosiye tek hücreli soy arasında ayrım yapamaz. Biz kısa tandem tekrarlar akış sitometrik sıralanmış hematopoetik progenitör hücre analizi uygulanmış ve bu seçili veri bloğu oluşturan biriminden – erythroid koloniler, elde edilen kısa tandem tekrarlar hem kemik toplanan analizi ile karşılaştırıldığında kemik iliği. Bu yöntem ile farklı yayılması ve donör hücreleri erythroid yerde farklılaşma göstermek edebiliyoruz. Bu teknik chimerism ayarlama kök hücre nakli yapılan geçerli izleme tamamlamak uygundur ve böylece uygulanan gelecekte klinik çalışmalar, kök hücre araştırma ve tasarım gen terapisi denemelerin olabilir.
Introduction
Allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) olduğunu aksi takdirde son derece tehlikeye için hastalıksız sağkalım oranları daha–dan %90 ulaşmak, hematopoetik sistem doğuştan genetik bozukluklar çeşitli için yalnızca kullanılabilir şifalı yaklaşım ve hayat-sınırlı hastalar1. Bu önemli tedavi aracı etkinliği öncesi toksisite sınırlayarak optimize edilmiştir- ve sonrası rejimleri2nakli, ama aynı zamanda kararlı greft işlevi sürdürülmesi hedef alan müdahaleler tarafından hangi sayısal yakın izleme tarafından donör kaynaklı hücreler3,4,5.
Zaman donör ve alıcı türetilmiş hücre çeşitli bir de aynı anda mevcut chimerism (MC) karışık terimi kullanılır, ancak genel olarak, tam chimerism (CC) lymphohematopoietic bölme donör kaynaklı hücreler tarafından toplam yedek anlamına gelir Oranlar. Split chimerism (SC) karışık chimerism erythroid bölümünde gibi tek hücreli soy gözlenen birlikteliği ifade eder. Hastaların hastalık nüks ve donör lenfosit infüzyon veya immünsüpresif azaltılması gibi başlatmak sonraki immunomodulatory stratejileri için duyarlı belirlemek yardımcı gibi chimerism durum HKHT aşağıdaki komut istemi belirlenmesi önemlidir terapiler6.
Engraftment HKHT sonra izlemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Isotyping immünglobulin ve sitogenetik analiz zavallı hassasiyet var ve çok biçimlilik7,8algılamak için onların yetenek sınırlıdır. Floresan situ hibridizasyon (balık) giriş hassasiyeti chimerism HKHT sonra izleme geliştirebilirsiniz ama seks uyumsuz allogrefler9‘ a sınırlı. Şu anda, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) chimerism algılamak için kullanılan en yaygın yöntemdir ve değişken sayı tandem yineler (VNTRs) geleneksel özel-Akrilamid Jel Elektroforez üzerinde dayanır veya kısa tandem (STRs) tekrarlar. Rutin olarak kullanılan kantitatif PCR HKHT takip kalan donör hücreleri son derece küçük bir oranda tespit edebilmektedir. Önemli çalışmalar defa kısıtlamasıdır MC algılama olgun eritrositler yerine çekirdekli hücrelerin varlığı neredeyse sadece sınırlı, yani işlevsel olarak hastalar için önemli Hemoglobinopati tarafından etkilenir hücreleri. Farklı kan grupları bulunan hastalarda, cytofluorometric analiz chimerism kırmızı kan hücrelerinde monoklonal antikorlar eritrosit antijenleri doğru ABO ve C, c, D, E ve e10 yönetmen kullanarak tespit edebilmek olduğunu hatırlamaya değer olduğunu , 11. chimerism erythroid Silsilesi içinde değerlendirilmesi farklı, ama çok ilginç bir araç akış sitometrik erythroid ataları ve erythroid yaratıcı çeşitli yelpazesi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri kültür tarafından boylama kombinasyonudur STR12analizi ile izledi. Bu yaklaşım donör ve alıcı chimerism erythroid yerde göreli oranları ölçmek yapabiliyor ve kemik iliği nakli sürdürebilmek için strateji kullanılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışmada amacı HKHT hastalarda takip erythroid ataları donör/alıcı chimerism analiz Hemoglobinopati için tedavi için seyirci iki yaklaşımın bir arada sunmaktır: 1.) floresan aktif hücre sıralama hematopoetik progenitör hücrelerin kemik iliği örneklerinde kısa tandem tekrarlar ve 2 analizi tarafından takip.) Koloni oluşturan birim büyüyen kemik iliği hücrelerinin atası çeşitli kolonilerde sınıflandırılması takip kısa tandem tekrar analiz tarafından. Bu yaklaşım yenilik donör/alıc?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
