기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍
1Mitchell Cancer Institute,University of South Alabama, 2College of Medicine,University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine,University of Zurich, 4Department of Dermatology,University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM),University of Zurich – Irchel Campus
Summary
이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.
Abstract
자가 세포 기반 요법 유도 만능 줄기 세포의 소개와 함께 현실로 한 걸음 더 가까이 있어. 양수 등 막 중간 엽 줄기 세포, 태아 줄기 세포는 독특한 조직 공학에서 및 iPSC 미래 소아 개입 및 줄기 세포 은행으로 프로그래밍에 대 한 약속을 가진 미 분화 세포의 종류를 나타냅니다. 여기에 제시 된 프로토콜 추출에 대 한 최적화 된 절차를 설명 하 고 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포를 배양 하 고 episomal 생성 유도 만능 줄기 세포 화학적으로 완전히 정의 된 문화에서이 세포에서 인간 재조합 형 vitronectin 고 E8 매체를 이용 하는 조건. -Cytometry, confocal 영상, 기형종 형성과 transcriptional 프로 파일링-엄격한 방법을 적용 하 여 새로운 라인의 특성은 또한 기술 된다. 새로 생성 된 라인 SSEA-1 표식에 대 한 부정 되 고 있는 동안 배아 줄기 세포-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-마커를 표현 한다. 줄기 세포 라인 teratomas scid 베이지색 쥐에 6-8 주에 고 teratomas는 포함 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직. 따라서이 방식은 동물 테스트 하는 매력적인 대안 그리고 모든 라인 만능 간주 bioinformatic pluripotency 평가 알고리즘 글로벌 식 microarray 데이터 전송 라인의 transcriptional 프로 파일링. 새로운 iPSC 라인 차별화 및 조직 공학의 최적화를 포함 하는 다운스트림 실험에서 쉽게 사용할 수 있습니다.
Introduction
유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 기술 발달 모델링, 잠재적인 세포 대체 요법, 질병 및 약물 및 독물학 심사1,2,3에 대 한 제공합니다. 대체 요법 개념적 세포 주입에 의해 달성 될 수 있다, 체 외에서 분화 (심장 패치) 등 조직 이식 또는 조직 공학에 의해 재생을 유도 합니다. 양수 (AFSC)와 막 줄기 세포 (AMSC)도 이러한 개입에 대 한 셀의 훌륭한 소스가 직접4,5,,67 또는 프로그래밍에 대 한 시작 셀 인구 로 pluripotency8,,910,,1112.
정의 되지 않은 문화 시스템을 사용 하는 초기 접근 또는9,10,,1112생성 방법의 수반 게놈 통합을 요구 하는 프로그래밍. 더 최근의 연구 iPSC 양수 유체 상피 세포에서 생성 하는 덜 정의 된 지하실 멤브레인 첨부 매트릭스 (BMM) 사용 되었다 하더라도 이종 무료 매체를 채택. 그러나, 기형종 형성 분석 결과 시험관 및 분자 데이터 함께 연구에 포함 되지. 양수 내 유체 상피 세포는 신생아 fibroblasts13에 비해 한 약 원죄 높은 재활 효율성이 있다을 발견 했다. 또 다른 연구에서는 양수에서 중간 엽 줄기 세포 또한 iPSC는 훨씬 더 높은 효율12로 재설정을 발견 했다.
만능 줄기 세포 조직 대표자 모든 3 세균 층으로 분화 될 수 있다 하 고 따라서 광범위 한 잠재력을가지고. 소아 환자 prenatally 수확, 프로그래밍, 그리고 그들의 헌 양수 액체 줄기 세포의 조직 공학에서 혜택을 수 있는 그리고 양수 막 줄기 세포 perinatally. 또한, 태아 줄기 세포 (성체 줄기 세포14,15보다 낮은)의 상대적으로 낮은 수준의 수 이론적으로 iPSC16소스 셀에서 관찰된 고정 후 바이어스의 해결에 도움이 됩니다.
여기에 우리가 현재 양수 프로그래밍에 대 한 프로토콜 및 막 줄기 세포의 pluripotency 화학적으로 재조합 vitronectin17 (VTN)18episomal 플라스 미드 사용 하 여 이종 무료 E8 매체를 정의. 프로그래밍에 대 한 셀의 원천으로 양수 액체와 막 셀의 주요 이점은 그들의 가용성을 사전에 속이 고 이렇게 주로 소아 조직 공학에 연구를 도움이 될 것 이라고 perinatally 및 따라서.
Protocol
프로토콜 인간 연구에 대 한 윤리 위원회의 기관 지침을 따릅니다. 환자 서 면된 동의 연구는 양수를 사용 하 여 얻은 했다. 이 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학 정책을 따릅니다. 1. 격리와 기본 양수 중간 엽 줄기 세포의 문화 양수 내 유체 세포의 도금 의사에 의해 amniocentesis 과정에서 수?…
Representative Results
정보 서 면된 동의 유전자 테스트 및 연구에 대 한 액체의 작은 약 수를 누리고 양수를 수확 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다. 아무 동의 태 반 의료 폐기물을 나타냅니다 연구에 양수 막의 사용에 대 한 필요 합니다. 양수 및 막 줄기 세포는 전형적인 엽 속성을 표시, 형태학 상으로 그들의 세포는 스핀 들-모양 및 위상-밝은. 프로그래밍, 셀 엽-상피 (메트로) 전환 받을…
Discussion
태아 줄기 세포에서 iPSC 생성의 초기 단계 태아 조직, 그들의 문화, 확장, 및 episomal 재활 플라스 미드의 소개에서 원본 셀의 추출 수반. 이 단계 뒤에 문화 기간 약 14 ~ 18 일 전에 첫 번째 완전히 재설정된 식민지 확장 될 수 있다. 마지막 단계는 iPSC 클론의 성숙. 양수 막 줄기 세포의 초기 추출은 amnion의 결합 된 기계 및 효소 소화에 의해 이루어집니다. 우리는 30 분의 부 화 시간이 결과 높은 생존 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 대학 취리히, 취리히 대학, 동호회 10.216 및 12.176에 스위스 사회의 심장, 스위스 국가 과학의 SCIEX NMS채널 의 Forschungskredit Fonds Medizinische Forschung에 의해 지원 되었다 재단 보조금 [320030-122273] 아래와 [310030-143992], 7 프레임 워크 프로그램, 생활 밸브, 그랜트 [242008], 올가 Mayenfisch 재단, EMDO 재단, 대학 병원 취리히 시작 그랜트 2012 유럽 위원회 및 미첼 암 연구소의 내부 자금입니다.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
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Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).