Anvendelse af automatiseret billedstyret patchklemme til undersøgelse af neuroner i hjerneskiver
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører automatiske billedstyrede patch-clamp-eksperimenter ved hjælp af et system, der for nylig er udviklet til standard in vitro- elektrofysiologiudstyr.
Abstract
Hele-celle patch clamp er guldstandardmetoden til måling af de enkelte cellers elektriske egenskaber. In vitro patch clamp forbliver imidlertid en udfordrende og lav gennemløbsteknik på grund af dets kompleksitet og høj afhængighed af brugerens drift og kontrol. Dette manuskript demonstrerer et billedstyret automatisk patch clamp system til in vitro helcelle patch clamp eksperimenter i akut hjerne skiver. Vores system implementerer en computersvisionsbaseret algoritme til at detektere fluorescensmærkede celler og målrette dem til fuldautomatisk patching ved hjælp af en mikromanipulator og intern pipette trykregulering. Hele processen er meget automatiseret, med minimal krav til menneskelig intervention. Realtids eksperimentelle oplysninger, herunder elektrisk modstand og intern pipettryk, dokumenteres elektronisk for fremtidig analyse og optimering til forskellige celletyper. Selvom vores system er beskrevet i sammenhæng med akut braiN skiveoptagelser, kan den også anvendes til den automatiserede billedstyrede patchclamp af dissocierede neuroner, organotypiske skivekulturer og andre ikke-neuronale celletyper.
Introduction
Patch-klemmeteknikken blev først udviklet af Neher og Sakmann i 1970'erne for at studere de ioniske kanaler af excitable membraner 1 . Siden da er patch clamping blevet anvendt til undersøgelsen af mange forskellige emner på det cellulære, synaptiske og kredsløbsniveau – både in vitro og in vivo – i mange forskellige celletyper, herunder neuroner, cardiomyocytter, Xenopus oocytter og kunstige liposomer 2 . Denne proces indebærer den korrekte identifikation og målretning af en celle af interesse, indviklet mikromanipulatorkontrol for at bevæge patchpipetten i nærheden af cellen, påføring af positivt og negativt tryk på pipetten på det rette tidspunkt for at etablere en stram gigasepatch, Og en indbrud for at etablere en helcelle patch konfiguration. Patch clamping udføres typisk manuelt og kræver omfattende træning til master. Selv for en forsker med plasterClamp, succesrate er forholdsvis lav. For nylig er der blevet forsøgt at automatisere patch-clamp eksperimenter. To hovedstrategier er udviklet til at opnå automatisering: Forøgelse af standard patch clamp udstyr til automatisk styring af patching processen og design af nyt udstyr og teknikker fra bunden. Den tidligere strategi kan tilpasses eksisterende hardware og kan anvendes i en række patch-klemme applikationer, herunder in vivo blind patch clamp 3 , 4 , 5 , in vitro patch clamp af akut hjerne skiver, organotypiske skive kulturer og dyrkede dissocierede neuroner 6 . Det gør det muligt at forhøre komplekse lokale kredsløb ved at bruge flere mikromanipulatorer samtidigt 7 . Den plane patch metode er et eksempel på den nye udviklingsstrategi, som kan opnå den høje gennemstrømning samtidig pAtch klemme af celler i suspension til lægemiddel screening formål 8 . Den plane patch-metode er imidlertid ikke anvendelig på alle celletyper, især neuroner med lange processer eller intakte kredsløb, der indeholder omfattende forbindelser. Dette begrænser dets anvendelse til kortlægning af det indviklede kredsløb i nervesystemet, hvilket er en vigtig fordel ved traditionel patch clamp-teknologi.
Vi har udviklet et system, der automatiserer den manuelle patch clamp proces in vitro ved at øge standard patch clamp hardware. Vores system, Autopatcher IG, giver automatisk pipettekalibrering, identifikation af fluorescerende celle, automatisk styring af pipettebevægelse, automatisk helcellepatching og datalogning. Systemet kan automatisk erhverve flere billeder af hjerneskiver på forskellige dybder; Analysere dem ved hjælp af computersyn Og ekstraher information, herunder koordinaterne af fluorescensmærkede celler. Disse oplysninger kan så væreBruges til at målrette og automatisk patchceller af interesse. Softwaren er skrevet i Python-et gratis, open source programmeringssprog – ved hjælp af flere open source-biblioteker. Dette sikrer dets tilgængelighed til andre forskere og forbedrer reproducerbarheden og rigoriteten af elektrofysiologiske eksperimenter. Systemet har et modulært design, således at ekstra hardware nemt kan forbindes med det nuværende system demonstreret her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode til automatiske billedstyrede patch clamp-optagelser in vitro . Nøgle trin i denne proces er opsummeret som følger. For det første bruges computersyn til automatisk at genkende pipettespidsen ved hjælp af en række billeder erhvervet via et mikroskop. Disse oplysninger bruges til at beregne koordinattransformationsfunktionen mellem mikroskopet og manipulatorkoordinatsystemerne. Computer vision bruges til automatisk at detektere fluorescensmærkede celler og at identificere deres k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for den økonomiske støtte fra Whitehall Foundation. Vi vil gerne takke Samuel T. Kissinger for de værdifulde kommentarer.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
