Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven
Summary
Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.
Abstract
Hele-cel patch klem is de gouden standaard methode om de elektrische eigenschappen van enkele cellen te meten. De in vitro patchclamp blijft echter een uitdagende en low-throughtechniek vanwege de complexiteit en hoge afhankelijkheid van gebruikersoperatie en -controle. Dit manuscript demonstreert een beeldgeleid automatische patchclamp systeem voor in vitro full-cell patch clamp experimenten in acute hersenplakken. Ons systeem implementeert een computergebaseerd algoritme om fluorescente gelabelde cellen te detecteren en te richten op volautomatische patches met behulp van een micromanipulator en interne pipetdrukregeling. Het gehele proces is zeer geautomatiseerd, met minimale eisen voor menselijke interventie. Realtime experimentele informatie, inclusief elektrische weerstand en interne pipettedruk, worden elektronisch gedocumenteerd voor toekomstige analyse en voor optimalisatie voor verschillende celtypen. Hoewel ons systeem wordt beschreven in het kader van acute braiN snijopnamen, kan het ook worden toegepast op de geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp van gedissocieerde neuronen, organotypische snijculturen en andere niet-neuronale celtypes.
Introduction
De patch clamp techniek werd in de jaren 1970 ontwikkeld door Neher en Sakmann om de ionische kanalen van excitabele membranen 1 te bestuderen. Sindsdien is patchclamping toegepast op de studie van veel verschillende onderwerpen op het cellulaire, synaptische en circuitniveau – zowel in vitro als in vivo – in veel verschillende celsoorten, waaronder neuronen, cardiomyocyten, Xenopus-oocyten en kunstmatige liposomen 2 . Dit proces omvat de juiste identificatie en targeting van een cel van belang, ingewikkelde micromanipulatorbesturing om de patchpipet in de nabijheid van de cel te bewegen, de toepassing van positieve en negatieve druk op het pipet op het juiste moment om een strakke gigasepatch te vestigen, En een inbraak om een configuratie van een hele celcartridge te maken. Patch klemmen worden doorgaans handmatig uitgevoerd en vereist uitgebreide training om te beheersen. Zelfs voor een onderzoeker die ervaring heeft met de patchKlem, de succesfrequentie is relatief laag. Meer recent zijn er meerdere pogingen gedaan om patch-clamp experimenten te automatiseren. Twee hoofdstrategieën zijn ontwikkeld om automatisering te verwezenlijken: standaard patch klem apparatuur verlenen om automatische controle van het patchproces en het ontwerp van nieuwe apparatuur en technieken vanaf de grond te bieden. De voormalige strategie is aan te passen aan bestaande hardware en kan worden gebruikt in een verscheidenheid aan patchclamp toepassingen, waaronder in vivo blind patch klem 3 , 4 , 5 , in vitro patch klem van acute hersenplakken, organotypische snij culturen en gekweekte gedissocieerde neuronen 6 . Het stelt de interrogatie van complexe lokale circuits mogelijk tegelijkertijd in gebruik door meerdere micromanipulatoren 7 . De platte patchmethode is een voorbeeld van de nieuwe ontwikkelingsstrategie, die de gelijktijdige p-high-throughput kan bereikenAtch klem van cellen in suspensie voor geneesmiddel screening doeleinden 8 . De platte patchmethode is echter niet van toepassing op alle celtypes, met name neuronen met lange processen of intacte schakelingen die uitgebreide verbindingen bevatten. Dit beperkt de toepassing ervan om de ingewikkelde schakelingen van het zenuwstelsel in kaart te brengen, wat een belangrijk voordeel is van de traditionele patchclamp-technologie.
We hebben een systeem ontwikkeld dat het handmatig patch clamp proces in vitro automatiseert door de standaard patch clamp hardware te versterken. Ons systeem, Autopatcher IG, biedt automatische pipette-kalibratie, identificatie van de fluorescerende cel, automatische controle van pipettebeweging, automatische full-cell patching en data logging. Het systeem kan automatisch meerdere beelden van breinschijfjes op verschillende diepten verwerven; Analyseren ze met behulp van computer visie; En extract informatie, inclusief de coördinaten van fluorescent gelabelde cellen. Deze informatie kan dan zijnGebruikt om de cellen van belang te richten en automatisch te patcheren. De software is geschreven in Python, een gratis open source-programmeertaal, met behulp van verschillende open-source bibliotheken. Dit zorgt voor toegankelijkheid voor andere onderzoekers en verbetert de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van elektrofysiologische experimenten. Het systeem heeft een modulair ontwerp, zodat extra hardware gemakkelijk kan worden aangesloten op het huidige systeem dat hier wordt aangetoond.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor automatische beeldgeleide patchclamp opnames in vitro . De belangrijkste stappen in dit proces worden als volgt samengevat. Ten eerste wordt computervisie gebruikt om de pipettip automatisch te herkennen met behulp van een reeks beelden die via een microscoop zijn verkregen. Deze informatie wordt dan gebruikt om de coördinaat transformatie functie te berekenen tussen de microscoop en de manipulator coördinatensystemen. Computervisie wordt gebruikt om fluorescent gelabelde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar voor de financiële steun van de Whitehall Foundation. We willen Samuel T. Kissinger bedanken voor de waardevolle opmerkingen.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
