식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

Zhicheng Zhang; Kurt Boonen; Meixia Li; Koen Geuten

doi:10.3791/56011

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방법 논문

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

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DOI:

10.3791/56011

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2017년 7월 28일

Zhicheng Zhang¹ , Kurt Boonen¹ , Meixia Li¹ , Koen Geuten¹

¹Department of Biology, KU Leuven

이 논문에서

요약

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

초록

RNA 결합 단백질 (RBP)은 RNA의 운명을 결정합니다. 그들은 모든 RNA 생합성 경로에 참여하며 특히 mRNA (messenger RNAs)의 전사 후 유전자 조절 (post-transcriptional gene regulation, PTGR)에 기여합니다. 지난 몇 년 동안, 효모 및 포유류 세포주의 많은 mRNA 결합 단백질은 mRNA 결합 단백질 (mRBPs)의 동정을 가능케하는 "mRNA 상호 작용 체 포획 (interaction)"이라는 새로운 방법의 사용을 통해 성공적으로 분리되었다. 생리적 인 환경에서 직접적으로. 이 방법은 올리고 (dT) 비드에 의한 메신저 리보 뉴클레오타이드 복합체 (mRNP)의 생체 내 자외선 (UV) 가교 결합, 풀다운 및 정제, 및 질량 분석기 (MS)에 의한 가교 결합 단백질의 후속 확인으로 구성된다. 아주 최근에 같은 방법을 적용하여 여러 가지 식물 mRNA 결합 프로테옴이 다른 Arabidopsis 조직 공급원에서 동시에보고되었다 : 뿌리 뽑힌 묘목, 잎 조직,엽초 엽 모세포 및 배양 된 뿌리 세포를 포함한다. 여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형질에 대한 최적화 된 mRNA 인터랙티브 캡쳐 방법을 제시하는데, 이는 다양한 세포 분석을 포함하는 실험을위한 다용도 도구의 역할을하는 세포 유형이다. 최적의 단백질 수율을위한 조건에는 조직의 시작과 UV 조사 시간이 포함됩니다. 중간 규모 실험 (10 ⁷ 세포)에서 얻은 mRNA 결합 프로테옴에서 RNA 결합 능력을 가진 RBP가 과다하게 나타 났으며 많은 새로운 RBP가 확인되었다. 실험을 확대 (10 ⁹ 세포) 할 수 있으며 최적화 된 방법을 다른 식물 세포 유형 및 종에 적용하여 식물에서 mRNA 결합 단백질을 광범위하게 분리, 분류 및 비교할 수 있습니다.

서론

진핵 생물은 세포 생물학적 과정을 유지하기 위해 다중 RNA 생합성 조절 경로를 사용합니다. 알려진 종류의 RNA 중에서 mRNA는 매우 다양하며 단백질과 그 이소 형의 코딩 용량을 가지고 있습니다 ^1. PTGR 경로는 pre-mRNA ² ^, ³ 의 운명을 지시합니다. 서로 다른 유전자 군의 RBP가 RNA의 조절을 조절하고, PTGR에서는 특정 mRBP가 기능적 mRNP를 형성하는 직접적인 물리적 상호 작용을 통해 mRNA를 유도합니다. 따라서, 식별 및 mRBPs의 특성과 mRNPs 것은 지난 30 년 .Over 세포의 mRNA 대사 ^2의 규정을 이해하는 데 중요하다, 다양한 시험 관내 방법 - RNA 전기 영동 이동성의 변화 (REMSA) 분석, 지수 농축 분석에 의한 리간드의 체계적 발전을 포함하여 (RBNS), 방사성 표지 또는 정량 분석 (RNA Bind-n-Seq, RBNS)형광 RNA 결합 분석, X 선 결정학 및 NMR 분광법은 ^{^4,} ^{^5,}