ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.
Abstract
Las proteínas de unión a ARN (RBPs) determinan el destino de los ARNs. Participan en todas las vías de la biogénesis del ARN y contribuyen especialmente a la regulación génica post-transcripcional (PTGR) de los ARN mensajeros (mRNAs). En los últimos años, se han aislado con éxito varios proteomas unidos a ARNm a partir de líneas de células de levaduras y mamíferos mediante el uso de un nuevo método denominado "captura de interactomas de mRNA", que permite la identificación de proteínas mRNA-binding (mRBPs) Directamente desde un entorno fisiológico. El método se compone de reticulación, pull-down y purificación de complejos de ribonucleoproteína mensajera (mRNPs) por bolas de oligo (dT) in vivo , y la posterior identificación de las proteínas reticuladas por espectrometría de masas (MS). Recientemente, aplicando el mismo método, se han reportado simultáneamente varios proteomas vegetales unidos a ARNm de diferentes fuentes de tejido de Arabidopsis : plántulas etioladas, tejido foliar,Protoplastos de mesófilo de hojas y células de raíces cultivadas. Aquí, presentamos el optimizado mRNA interactome método de captura de Arabidopsis thaliana hoja mesofilo protoplastos, un tipo de célula que sirve como una herramienta versátil para los experimentos que incluyen diversos ensayos celulares. Las condiciones para un rendimiento óptimo de la proteína incluyen la cantidad de tejido de partida y la duración de la irradiación UV. En el proteoma unido a ARNm obtenido a partir de un experimento de escala media (10 ^ { 7} células), se encontró que las RBP que tenían capacidad de unión a ARN estaban sobre-representadas y se identificaron muchas RBP nuevas. El experimento se puede ampliar (10 9 células), y el método optimizado se puede aplicar a otros tipos de células vegetales y especies para aislar, catalogar y comparar los proteomas unidos a mRNA en las plantas.
Introduction
Los eucariotas utilizan múltiples vías reguladoras de la biogénesis del ARN para mantener los procesos biológicos celulares. Entre los tipos conocidos de ARN, el ARNm es muy diverso y lleva la capacidad de codificación de las proteínas y sus isoformas 1. La ruta PTGR dirige los destinos de los pre-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes familias de genes controlan la regulación de ARN, y en PTGR, mRBPs específicos guían mRNAs a través de interacciones físicas directas, formando mRNPs funcional. Por lo tanto, la identificación y caracterización de mRBPs y sus mRNPs es fundamental para entender la regulación del metabolismo del mRNA celular 2. Durante las últimas tres décadas, varios métodos in vitro – incluyendo los ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de ARN (REMSA), evolución sistemática de ligandos mediante ensayos de enriquecimiento exponencial (SELEX) basado en constructos derivados de la biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcado o cuantitativoEnsayos de unión a ARN de fluorescencia, cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – se han aplicado ampliamente a estudios de RBP, principalmente a partir de células de mamífero. Los resultados de estos estudios de mamíferos RBPs se puede buscar a través de la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), que recoge las observaciones publicadas [ 10] .
Aunque estos enfoques in vitro son herramientas de gran alcance, que determinan los motivos de ARN unido de un determinado grupo de RNA de secuencias y por lo tanto, están limitados en su capacidad para descubrir nuevos ARN objetivo. Lo mismo es cierto para las estrategias computacionales para predecir el genoma de todo RBPs, que se basan en la conservación de la secuencia de proteínas y la estructura [ 15] . Para superar esto, un nuevo método experimental haSe ha establecido que permite la identificación de los motivos de ARN que un RBP de interés interactúa con, así como para la determinación de la ubicación precisa de la unión. Este método, denominado "reticulación e inmunoprecipitación" (CLIP), está compuesto de reticulación UV in vivo seguida por inmunoprecipitación 11 . Los primeros estudios han demostrado que la fotoactivación de nucleótidos de ADN y ARN puede ocurrir a una longitud de onda UV de excitación mayor que 245 nm. La reacción a través de la timidina parece ser favorecida (rango en orden de disminución de la fotoreactividad: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Usando luz UV con una longitud de onda de 254 nm (UV-C), se observó que se crean enlaces covalentes entre nucleótidos de ARN y residuos de proteína cuando están en el rango de sólo unos pocos Angstroms (Å). Por lo tanto, el fenómeno se denomina reticulación de "cero longitud" de RNA y RBP. Esto puede ser seguido por un procedimiento de purificación estricto Con poco fondo 13 , 14 .
Una estrategia complementaria al CLIP consiste en combinar la reticulación UV in vivo con la identificación de proteínas para describir el paisaje de las RBP. Se han aislado varios proteomas unidos a mRNA de este genoma de células de levadura, células madre embrionarias (ESCs) y líneas celulares humanas ( es decir, HEK293 y HeLa) usando este nuevo enfoque experimental, denominado "captura de interactomas de mRNA" 18 , 19 , 20 , 21 . El método se compone de reticulación UV in vivo seguida por purificación de mRNP y proteómica basada en MS. Mediante la aplicación de esta estrategia, se han descubierto muchas RBP no lineales que contienen RBDs no canónicos y se ha puesto de manifiesto que más proteínas tienen capacidades de unión a ARN de lo que se suponía anteriormente"> 15, 16, 17. El uso de este método permite nuevas aplicaciones y para la capacidad de responder a las nuevas preguntas biológicos en la investigación de las prácticas comerciales restrictivas. Por ejemplo, un estudio reciente ha investigado la conservación del proteoma ARNm unido (el núcleo RBP Proteoma) entre la levadura y las células humanas [ 22] .
Se ha descubierto que las RBP de las plantas están implicadas en el crecimiento y desarrollo ( por ejemplo , en la regulación post-transcripcional del tiempo de floración, el reloj circadiano y la expresión génica en mitocondrias y cloroplastos) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Además, se piensa que desempeñan funciones en los procesos celulares que responden a tensiones abióticas ( por ejemplo, frío, sequía, saLinidad y ácido abscísico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Existen más de 200 genes RBP predichos en el genoma de Arabidopsis thaliana , basados en motivos de secuencia de dominio de reconocimiento de ARN (RRM) y homología K (KH); En el arroz, aproximadamente 250 se han observado 35 , 36 . Es notable que muchos RBPs predicho parecen ser únicos a las plantas ( por ejemplo, ningún orthologs del metazoan a aproximadamente el 50% de RBP predichas de Arabidopsis que contienen un dominio de RRM) 35 , sugiriendo que muchos pueden servir a nuevas funciones. Las funciones de la mayoría de las RBP predicho siguen sin caracterizar [ 23] .
El aislamiento de proteomas unidos a ARNm de plántulas etioladas de Arabidopsis , tejido foliar, células de raíces cultivadas y protoplastos de mesofilo de hoja mediante el uso deMRNA interactome captura se ha informado recientemente 38 , 39 . Estos estudios demuestran el fuerte potencial de catalogar sistemáticamente las RBP funcionales en las plantas en un futuro próximo. Aquí, presentamos un protocolo para mRNA interactome captura de protoplastos de plantas ( es decir, células sin paredes celulares). Los protoplastos de mesofila de la hoja de Arabidopsis thaliana son el tipo principal de células foliares. Los protoplastos aislados permiten el acceso óptimo de la luz UV a las células. Este tipo de células se puede utilizar en ensayos que transitoriamente expresar proteínas para la caracterización funcional [ 40 , 41] . Además, la protoplastía se ha aplicado a varios otros tipos de células vegetales y especies 42 , 43 , 44 ( por ejemplo, Petersson et al ., 2009; Bargmann y Birnbaum, 2010 y Hong et al ., 2012).
<P class = "jove_content"> El método abarca un total de 11 pasos ( Figura 1A ). Los protoplastos de mesofilo de hoja de Arabidopsis se aislan primero (etapa 1) y posteriormente se irradian con UV para formar mRNPs reticulados (etapa 2). Cuando los protoplastos se lisan en condiciones desnaturalizantes (etapa 3), los mRNP reticulados se liberan en tampón de lisis / unión y se extraen por perlas de oligo-d (T) 25 (etapa 4). Después de varias rondas de lavados rigurosos, los mRNP se purifican y se analizan adicionalmente. Los péptidos desnaturalizados de mRBPs son digeridos por proteinasa K antes de purificar los ARNm reticulados y la calidad de ARN se verifica mediante qRT-PCR (etapas 5 y 6). Después del tratamiento con RNasa y la concentración de proteína (etapa 7), la calidad de la proteína se controla mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y tinción con plata (etapa 8). La diferencia en los patrones de bandas de proteína puede visualizarse fácilmente entre una muestra reticulada (CL) y una muestra no reticulada (no CL;La muestra de control negativo de protoplastos que no está sometida a irradiación UV). La identificación de proteínas se logra mediante la proteómica basada en la EM. Las proteínas de la muestra de CL se separan mediante electroforesis unidimensional en gel de poliacrilamida (1D-PAGE) para eliminar la posible contaminación de fondo, se digieren en gel en péptidos cortos usando tripsina y se purifican (etapa 9). La cromatografía líquida de fase inversa nanométrica acoplada a espectrometría de masas (nano-LC-MS) permite la determinación de la cantidad de proteínas definitivas en el proteoma ligado al mRNA (paso 10). Finalmente, las mRBPs identificadas se caracterizan y catalogan usando el análisis bioinformático (paso 11).Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicamos con éxito la captura de interactomas de mRNA, desarrollada para levaduras y células humanas, para plantar protoplastos de mesofilo en hojas. Las células del mesófilo de la hoja son el tipo principal de tejido de tierra en hojas de la planta. La principal ventaja de este método es que utiliza reticulación in vivo para descubrir las proteínas de un entorno fisiológico.
En este protocolo, presentamos principalmente una serie de condiciones experimentales optimizadas (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el laboratorio del Prof. Joris Winderickx, que proporcionó el aparato de reticulación UV equipado con la lámpara UV convencional. KG cuenta con el apoyo del fondo de investigación KU Leuven y reconoce el apoyo de la subvención FWO G065713N.
Materials
| REAGENTS | |||
| 0.8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Primary isotonic Enzyme solution & MMg solution |
| 2M KCl | MERCK | Art. 4935 | Primary isotonic Enzyme solution & W5 buffer |
| 0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid) |
Sigma-aldrich | M2933 | Primary isotonic Enzyme solution, W5 buffer & MMg solution, Filtration sterilization |
| Cellulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELLULASE “ONOZUKA” R-10, 10 g |
Final isotonic enzyme solution |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Final isotonic enzyme solution |
| 10% (w/v) BSA (Bovine Serum Albumin) |
Sigma-aldrich | A7906-100G | Final isotonic enzyme solution & Filtration sterilization |
| 1M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Final isotonic enzyme solution, W5 buffer & Digestion buffer |
| 1M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 buffer |
| 2M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg solution |
| 1M LiCl (Lithium Chloride) |
Acros | 199885000 | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 & Low salt buffer |
| 5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate) |
Sigma-aldrich | L4632-25G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1 & Filtration sterilization |
| 1M DTT (Dithiothreitol) |
Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 & Wash buffer 2 |
307866 | Lysis/binding buffer, |
| 1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical |
167620010 & H/1200/PB15 |
Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-aldrich | ED-500G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 0.1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 1X PBS (pH 7.4) (Phosphate Buffered Saline) containing (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4) |
Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC |
S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 |
Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| Proteinase K solution (2 μg/μL) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Protein digestion |
| Loading dye | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
| qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR assay |
| RNase Cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | RNA digestion |
| Methanol | Sigma-aldrich | 322415 | Gel fixation and gel destaining |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 537020 | Gel fixation and gel destaining |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Gel staining |
| 1M NH4HCO3 (Ammonium bicarbonate) |
Sigma-aldrich | 09830-500G | Gel hydration & Digestion buffer |
| CH3CN (Acetonitrile) |
Sigma-aldrich | 34851-100ML | Gel dehydration & Peptide dissolving solution |
| IAA (Iodoacetic acid) |
Sigma-aldrich | I4386-10G | Alkylating agent |
| TFA (Trifluoroacetic acid) |
Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Peptide dissolving solution |
| FA (Formic acid) |
Sigma-aldrich | 06554-5G | Peptide extraction |
| Trypsin solution (6 ng/μL) | Promega | V5280 | Digestion buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Plant growth |
| Vermiculite 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Plant growth |
| Petri dish (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Carrier for protoplast suspension |
| 0.22 μm filter | Millipore | SE2M229104 | Homogenization of final isotonic enzyme solution |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Rosette leaf strips |
| 35-75 μm nylon mesh | SEFAR NITEX | 74010 | Protoplast suspension filtration |
| 50 mL round bottom tubes | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Carrier for protoplast suspension |
| Hemocytometer (Bürker hemocytometer) |
MARIENFELD | 650030 | Protoplast cell counting |
| UV crosslinking apparatus (HL-2000 HybriLinker) |
UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo UV crosslinking |
| UV lamp (Sankyo-Denki G8T5) |
SANKYO DENKI |
SD G8T5 | in vivo UV crosslinking |
| 50 mL glass syringe | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogenization of protoplast lysate |
| Narrow needle (0.9 x 25 mm) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Homogenization of protoplast lysate |
| Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Sample incubation by rotating |
| Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL) |
New England BioLabs | S1419S | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Magnetic rack | Invitrogen | CS15000 | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Centrifugal filter units (Amicon Ultra-4 centrifugal filter units) |
EMD Millipore | UFC800308 | mRBP concentration |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | Silver-staining assay |
| RNA purification kit (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) |
STRATEC Molecular | 1064100300 | RNA purification |
| Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | RNA quality and quantity |
| Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler) |
Thermo Fisher Scientific | 4376600 | cDNA quantification |
| µ-C18 columns (Millipore Zip Tip µ-C18 columns) |
Sigma-aldrich | 720046-960EA | Peptide purification |
| Mass spectrometer (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) |
Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Mass spectrometry-based proteomics |
| Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column) |
Thermo Fisher Scientific | ES800 | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn) |
Thermo Fisher Scientific | 160321 | Mass spectrometry-based proteomics |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | Sequences | ||
| UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) |
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA |
||
| 18S rRNA (Durut et al., 2014) |
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
||
References
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
- Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
- Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
- Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
- Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
- Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
- Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
- Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
- Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
- Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
- Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
- Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
- Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
- Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
- Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
- Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
- Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
- Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
- Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
- Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
- Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
- Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
- Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
- Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
- Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
- Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
- Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
- Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
- Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
- Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
- Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
- Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
- Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
- Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
- Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
- Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
- Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
- Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
