Målet med denne protokol er at isolere endotelceller stamceller fra navlestrengsblod. Nogle af applikationer omfatter brug af disse celler som en biomarkør for at identificere patienter med hjerte-kar-risiko, behandling af iskæmisk sygdomme, og at skabe væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner.
Eksistens i endothelial stamceller (EPCs) i perifert blod og sit engagement i vasculogenesis blev først rapporteret af Ashara og kolleger1. Senere, dokumenteret andre eksistensen af lignende typer af EPCs stammer fra knoglemarven2,3. Mere nylig, Yoder og Ingram viste at EPCs stammer fra navlestrengsblod havde en højere proliferativ potentiale i forhold til dem isoleret fra voksen perifere blod4,5,6. Ud over at være involveret i postnatal vasculogenesis, har EPCs også vist lovende som en celle kilde til oprettelse af væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner7,8. Forskellige isolation protokoller findes, hvoraf nogle omfatter celle sortering af mononukleære celler (multinationale selskaber), der stammer fra kilder nævnt tidligere ved hjælp af endotel og hæmatopoietisk markører, eller dyrkning af disse multinationale selskaber med specialiserede endotel vækst medium, eller en kombination af disse teknikker9. Her præsenterer vi en protokol til isolering og kultur af EPCs ved hjælp af specialiseret endotel medium suppleret med vækstfaktorer, uden brug af immunosorting, efterfulgt af en karakterisering af isolerede celler ved hjælp af Western blotting og immunfarvning.
Flere forskere har studeret karakteristika og potentiale af menneskelige EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan betegnes som cirkulerende celler, der har evnen til at overholde endotel væv i lokaliteter af hypoxi, iskæmi, skade eller tumordannelse og bidrage til dannelsen af nye vaskulære strukturer4,14. Deres observerede inddragelse i neovascularization, i form af postnatal vasculogenesis, har ført til en forståelse af Patofysiologi af disse celler og deres anvendelse i terapeutiske anvendelser4,15, 16. antallet af EPCs i individ har vist sig at være korreleret med hjerte-kar-patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andre undersøgelser har også opdelte EPCs ind i en ventil fibroblast-lignende fænotype og foreslået, at disse celler kan bruges til vævsmanipulering hjerte ventiler7,21.
Bestemt celle overflade molekyler nødvendigt at isolere EPCs er ikke blevet klart identificeret på grund af uoverensstemmelser mellem undersøgelser4. Vedhæftning af multinationale selskaber til en bestemt matrix, med udsættelse for en række dyrkningsbetingelser, er udført af flere grupper1,17,22,23, tyder på, at formodede EPCs kan vise forskellige fænotypiske egenskaber. Disse egenskaber omfatter manglende phagocytotic evne, tube dannelse i Matrigel og optagelsen af Dil-acetyleret low-density lipoprotein. Høj clonogenic og proliferativ potentiale er to egenskaber med hvilke EPCs kan være hierarchized5. EPCs kan også indgå i vitro tubuli når cocultured med menneskelige fosterets lunge fibroblaster4. Disse celler er kendt for at udtrykke endotel celle overflade markører og at dele nogle af hæmatopoietisk markører13,24,25. De positivt udtryk markører, der er bredt accepteret til fænotyper EPCs er CD31, CD34, vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrands faktor (vWF), CD133, c-Kit, og vaskulære endotel cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler, der co express CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-glat muskel aktin (α-SMA) ikke anses for at være EPCs på grund af deres begrænsede proliferativ potentielle, evne til at phagocytosis bakterier, og manglende evne til at danne de novo menneskelige fartøjer i vivo4,7. Denne artikel beskriver en modificeret protokol for isolation i endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod uden behov for enhver celle sortering protokoller. Til denne artikel brugt vi CD31, CD34 og VEGFR2 som de positive markører, med α-SMA som negativ indikator.
I denne artikel foreslår vi en metode til at isolere og dyrkning endotelceller stamceller fra navlestrengsblod uden celle sortering ved hjælp af specialiseret endotel vækstmediet suppleret med vækstfaktorer (EGM). Denne EGM indeholder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF), som forbedrer overlevelsen, spredning og migration af endothelceller26. Det omfatter også ascorbinsyre, som er ansvarlig for at vedligeholde den brostensbelagte morfologi af celler; insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1), som giver angiogene og vandrende funktion; og heparin, som medfører forbedret stabilitet på lang sigt af vækstfaktorer i de mellemstore26. Andre vækstfaktorer, tilføjes i endothelial cellekulturmedium omfatter tilskud med epidermal vækst faktor (EGF), som hjælper med at stimulere celleproliferation og differentiering og hydrocortison, som sensitizes celler til EGF26 . Vi viser, at brugen af denne særlige vækstmedium giver højere antal EPCs sammenlignet med endotel basal medium (EBM) eller Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM).
Som tidligere nævnt tilhænger EPCs besidder en cobblestone morfologi. Vores isolerede Middelhavstredjelandene skred fra en spindel-formet celle koloni (figur 2A-2D) i de tidlige stadier til en cobblestone koloni (figur 2E-2F) over en periode af ti dage i kultur. EPCs er blevet stemplet forskelligt af forskellige forskergrupper, nemlig som sent endotel stamfader celler10, endotel kolonidannende celler<su…
The authors have nothing to disclose.
Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr. CMMI-1452943 og af University of Arkansas udmærkelse College. Vi vil også gerne anerkende Arkansas ledning blodbank for at forsyne os med ledningen blod enheder.
A) For isolation and culturing | |||
EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
B) Antibodies and cell lysates | |||
CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
C) Western blotting and immunostaining | |||
10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |