Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano
Summary
El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.
Abstract
La existencia de células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre periférica y su implicación en la vasculogénesis primero fue divulgado por Ashara y colegas1. Más tarde, otros documentaron la existencia de tipos similares de EPCs procedentes de médula ósea2,3. Más recientemente, Yoder y Ingram demostró que EPCs derivan de la sangre del cordón umbilical tenían un potencial proliferativo más alto en comparación con los aislados de adulto periférico sangre4,5,6. Aparte de estar involucrado en la vasculogénesis posnatal, EPCs también han demostrado promesa como fuente de células para crear ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula construcciones7,8. Existen varios protocolos de aislamiento, algunas de las cuales implican la clasificación de la célula de células mononucleares (MNCs) derivadas de las fuentes mencionadas anteriormente con la ayuda de marcadores endoteliales y hematopoyéticas, o cultivo de estas multinacionales especializados crecimiento endotelial medio, o una combinación de estas técnicas9. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultura de EPCs usando especializado endotelial suplementado con factores de crecimiento, sin el uso de immunosorting, seguido de la caracterización de las células aisladas mediante Western Blot y immunostaining.
Introduction
Varios investigadores han estudiado las características y el potencial de humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs pueden describirse como la circulación de las células que tienen la capacidad de adherirse al tejido endotelial en sitios de hipoxia, isquemia, lesiones o la formación del tumor y contribuir a la formación de nuevas estructuras vasculares4,14. Su participación observado en neovascularización, en forma de vasculogénesis posnatal, ha conducido a una comprensión de la patofisiología de estas células y su uso en aplicaciones terapéuticas4,15, 16. el número de EPC en un individuo se ha demostrado para ser correlacionado con patología cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Otros estudios han también diferenciado EPCs en un fenotipo de fibroblasto-como de la válvula y que estas células podrían utilizarse para ingeniería de tejidos corazón válvulas7,21.
Las moléculas de superficie celular particular necesarias aislar a EPCs no han sido claramente identificadas debido a las discrepancias entre las investigaciones4. La adhesión de las empresas multinacionales a una matriz, con la exposición a una variedad de condiciones de cultivo, se ha realizado por varios grupos1,17,22,23, sugiriendo que EPCs putativos puede Mostrar diferentes propiedades fenotípicas. Estas propiedades incluyen la falta de capacidad phagocytotic, formación del tubo en Matrigel y la captación de lipoproteínas de baja densidad Dil-acetilado. El potencial proliferativo y clonogenic alta son dos propiedades con que EPC puede ser jerarquizada5. EPCs pueden también formar en vitro de túbulos cuando morfología de fibroblastos de pulmón fetal humano4. Se conocen estas células expresan marcadores de superficie celular endotelial y compartir algunos de los marcadores hematopoyéticos13,24,25. Los marcadores expresados positivamente que son ampliamente aceptados para EPCs phenotyping son CD31, CD34, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (FvW), CD133, c-Kit y vascular endotelial cadherina (VE-cadherina)4 , 18. las células que expresan Co CD90, CD45, CD14, CD115 o actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) no se consideran ser EPC debido a su limitada proliferativa potencial, capacidad de fagocitar bacterias e incapacidad para formar de nuevo humano vasos en vivo4,7. Este artículo describe un protocolo modificado para el aislamiento de las células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón umbilical humano sin necesidad de cualquier célula clasificación de protocolos. Para este artículo, utilizamos CD31, CD34 y VEGFR2 como los marcadores positivos, con α-SMA como el indicador negativo.
En este artículo, proponemos un método de aislamiento y cultivo de células endoteliales progenitoras de sangre del cordón umbilical sin clasificar usando la célula especializada medio crecimiento endotelial suplementado con factores de crecimiento (EGM). Este EGM contiene factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF), que mejoran la supervivencia, proliferación y migración de células endoteliales26. También incluye el ácido ascórbico, que es responsable de mantener la morfología de adoquines de células; insulina-como factor de crecimiento-1 (IGF-1), que proporciona angiogénicos y función migratoria; y heparina, la cual causa mayor estabilidad a largo plazo de factores de crecimiento en el medio26. Otros factores de crecimiento añadidos al medio de cultivo de células endoteliales incluye la suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF), que ayuda a estimular la proliferación celular y la diferenciación y la hidrocortisona, que sensibiliza las células al EGF26 . Nos muestran que el uso de este medio de crecimiento produce un número mayor de EPCs en comparación con medio basal endotelial (EBM) o modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco).
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se mencionó anteriormente, adherente EPCs poseen una morfología de adoquines. Nuestras multinacionales aisladas progresaban de una colonia de células fusiformes (figura 2A-2D) en las primeras etapas a una colonia de adoquines (figura 2E-2F) durante un período de diez días en la cultura. EPC ha sido etiquetados como diferentemente por diferentes grupos de investigación, es decir, como10finales d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. CMMI-1452943 y por el Colegio de honores de la Universidad de Arkansas. También quisiéramos reconocer el Banco de sangre de cordón de Arkansas por facilitarnos con unidades de sangre de cordón.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
