تحليل شبه الآلي للماوس الهيكل العظمى والعضلات مورفولوجيا وتكوين نوع الألياف
Summary
المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة الميوسين نشأ المميز من أحدث من نوع الألياف العضلية الهيكلية (أيالنوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، واكتب منظمة شات، اكتب الثاني باء). نقدم هنا، بروتوكول المصبوغة جنبا إلى جنب مع خوارزمية رواية شبه إليه التي تسهل تقييم سريع مورفولوجية نوع الألياف والألياف.
Abstract
لسنوات، كانت أفضل تصور الفروق بين أنواع الألياف العضلية الهيكلية تلطيخ الميوسين-ATPase. في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز الدقيقة لنوع الألياف. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويمكن الآن تحديد نوع ألياف IIB بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميك؛ ومع ذلك، دليل تحليل هذه البيانات يمكن أن تكون بطيئة وأسفل يمين مملة. وفي هذا الصدد، تقييم سريعة ودقيقة لتكوين نوع الألياف ومورفولوجيا أداة مرغوب فيه جداً. نقدم هنا، على بروتوكول للدولة من أحدث المناعي تلطيخ من ميكس في الأجزاء المجمدة التي تم الحصول عليها من الماوس اللكتات العضلات في الحفل مع خوارزمية شبه الآلي رواية أن يسرع تحليلاً مورفولوجيا نوع الألياف والألياف. كما هو متوقع، عرض العضلات سوليوس تلطيخ للنوع الأول والنوع ألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين، ولكن ليس لنوع منظمة شات أو نوع ألياف IIB. من ناحية أخرى، كانت تتألف أساسا من الألياف نوع منظمة شات والنوع الثاني باء، جزء صغير من نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين العضلات الظنبوبي الأمامي وقليلاً أو لا النوع الأول من الألياف. واستخدمت عدة تحولات الصورة لتوليد خرائط احتمال غرض قياس جوانب مختلفة من الألياف مورفولوجيا (أيمساحة مقطعية (CSA)، قطرها فيرت القصوى والدنيا). القيم التي تم الحصول عليها لهذه المعلمات ثم قورنت مع القيم التي تم الحصول عليها يدوياً. لوحظت لا توجد اختلافات كبيرة بين أما طريقة التحليل فيما يتعلق بوكالة الفضاء الكندية، قطرها فيرت القصوى أو الدنيا (كل ف > 0.05)، مما يشير إلى دقة أسلوبنا. وبالتالي، يمكن تطبيق لدينا بروتوكول تحليل إيمونوستاينينج للتحقيق في الآثار على تكوين العضلات في العديد من النماذج للشيخوخة وعضلي.
Introduction
كان معروفا لبعض الوقت أن الهيكل العظمى والعضلات وتتألف من ألياف واحدة من العديد من أنواع1. في البداية، تميزت مجموعتان من الألياف استناداً إلى خصائصها الهوس واسمه، على النحو المناسب، بطيء نشل (النوع الأول) وسريع نشل (النوع الثاني). كذلك تتميز هذه الفئات على أساس التمثيل الغذائي من الألياف. النوع الأول من منذ ذلك الحين ألياف غنية في الميتوكوندريا وتعتمد على الأيض الأكسدة، تم توضيح ديافوراسي ريدكتيز (NADH-أون) tetrazolium نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide قوة إيجابية2 أو succinate نازعة (SDH)3 تلوين. وفي المقابل، عرضت ألياف النوع الثاني أقل ودرجات متفاوتة من ديافوراسي NADH-TR أو المحددات تلطيخ، وتنقسم إلى مجموعتين فرعيتين سريع نشل (النوع IIA والنوع الثاني باء) نوعا ما بدائية تستند إلى قدراتها الأكسدة النسبي. وقد تم تصور هذه الفروق بين ألياف أكثر فعالية تلطيخ الميوسين-ATPase النوع الأول من حيث الألياف وصمة عار الظلام بعد حضانة قبل في pH 4.0 والنوع الثاني باء الألياف امتصاص المتعجل الحضانة قبل التالية في pH 10.0 مع نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين تلوين العولم4.
في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز أدق من الألياف من نوع5. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، والنوع الثاني باء ألياف يمكن الجميع التعرف بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميهك. وباﻹضافة إلى ذلك، نوع آخر من الألياف أيضي-متوسط سريع نشل، اكتب منظمة شات، قد حددت6. كما كانت ألياف الهجين معربا عن ميهك أكثر من مؤكدة5،،من78. بعض الأنواع مثل القط والبابون معروفة لا للتعبير عن “النوع الثاني باء ميكس”6. على الرغم من إيمونوستينينج ميك حاليا على تقدير الدولة للفنون لتكوين العضلات، تحليل البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب مرهقة وتستغرق وقتاً طويلاً من دون مساعدة الآلي. وتحقيقا لهذه الغاية، كانت حفنة من أساليب شبه الآلي لتحليل هذه البيانات المتقدمة5،،من910. نقدم هنا، بروتوكول قياسي نسبيا لتحديد نوع الألياف العضلية5،،من78،10، المناعي جنبا إلى جنب مع رواية شبه الآلي الخوارزمية التي تسارع تحليل مورفولوجيا نوع الألياف والألياف بدقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وقد قدمنا الاتجاه مفيدة للتعرف على أنواع الألياف العضلية الهيكلية. في القيام بذلك، يمكننا وصف خوارزمية جديدة لتحليل البيانات.
نظراً للنتائج التي توصلنا إليها إلى حد بعيد تأكيد تلك التقارير السابقة5،،من810 وتعكس القيا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لمؤسسة بوتشير ورابطة التصلب العضلي الجانبي (#17–ثانيا-344) على دعمها لهذا البحث.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
