ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג
Summary
נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.
Abstract
במשך שנים, היו הבחנות בין סוגי סיבי שריר השלד הטוב דמיינו ידי מכתימה צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase. לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סוג סיבים. מסוג I, הקלד IIA, הקלד IIX ו סיבים מסוג IIB עכשיו יכול להיות מזוהה עם דיוק בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC; עם זאת, ניתוח ידנית של נתונים אלו יכול להיות איטי ולא גמור מייגע. בהקשר זה, הערכה מהירה, מדויקת של סיבים מסוג הרכב מורפולוגיה הוא כלי מאוד רצוי. כאן, אנו מציגים עבור המדינה-of-the-art נוגדן של MyHCs בסעיפים קפוא המתקבל העכבר שריר hindlimb בהופעה עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן שמאיץ את ניתוח סיבים מסוג וסיבים מורפולוגיה של פרוטוקול. כצפוי, שריר הסוליה מוצג צביעת עבור מסוג I ו סיבים IIA, אך לא עבור סוג IIX או סוג סיבי IIB. מצד שני, שריר השוקה הקדמי היה ברובו מורכב סוג IIX ו- type IIB סיבים, חלק קטן של סוג IIA סיבים, מעט או ללא סוג סיבים. מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות לצורך מדידת היבטים שונים של סיבים מורפולוגיה (קרי, שטח חתך הרוחב (CSA), קוטר Feret מקסימלית וללא מינימלי). הערכים שהתקבלו עבור פרמטרים אלו הושוו עם ערכים שהושג באופן ידני. אין הבדלים משמעותיים נצפו בין בכל מצב של ניתוח לגבי CSA, קוטר Feret מינימלי או מקסימלי (כל p > 0.05), המציין את הדיוק של שיטת שלנו. לפיכך, פרוטוקול הניתוח שלנו immunostaining ניתן להחיל את החקירה של השפעות על השריר הרכב דגמים רבים של הזדקנות, מיופתיה.
Introduction
זה כבר ידוע מזה זמן כי שרירי השלד מורכב של סיבי יחיד של סוגים רבים1. בתחילה, שתי קבוצות של סיבי מאופיינים על סמך מאפייניהם כויץ ו בשם, בהתאם, איטי עווית (סוג), במהירות עווית (סוג II). קטגוריות אלה היו מכובדים נוספים על בסיס סיבים חילוף החומרים. מאז סוג סיבים עשירים המיטוכונדריה, מסתמך על מטבוליזם חמצוני, הם היו הובהר על-ידי nicotinamide אדנין dinucleotide robustly חיובי-tetrazolium רדוקטאז (NADH-TR) diaphorase2 או succinate דהידרוגנאז (SDH)3 מכתים. לעומת זאת, סוג II סיבי הציג פחותה מעלות משתנה של NADH-TR diaphorase או SDH מכתים, חולקו לשתי תת-קבוצות במהירות עווית (מסוג IIA ו- IIB) במידה מסוימת בגסות על סמך קיבולות חמצוני היחסי שלהם. הבדלים אלו בין סיבי היה רוחי בצורה יעילה יותר על ידי צביעת צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase שבו סוג סיבים כתם כהה לאחר דגירה מראש ב- pH 4.0 ולקלוט מסוג IIB סיבי precipitate דגירה לפני הבא ב- pH 10.0 בסיבי IIA סוג צביעת intermediately4.
לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סיבים מסוג5. סוג אני, הקלד IIA, מסוג IIB סיבים ניתן כל לזהות בדייקנות בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC. בנוסף, במהירות עווית סמויה ביניים סיבים מסוג אחר, הקלד IIX, היה מזוהה6. סיבי היברידית לבטא MyHC אחד או יותר היו גם אושרו5,7,8. מינים מסוימים כגון החתול הבבון ידועים לא מסוג IIB MyHCs אקספרס6. למרות MyHC immunostaining הוא כעת הערכת המדינה-of-the-art הקומפוזיציה שריר, הניתוח של הנתונים שהושגו באמצעות טכניקה זו היא מסורבלת ולדרוש זמן רב ללא עזרה אוטומטית. לשם כך, קומץ בשיטות אוטומטיות למחצה כדי לנתח את הנתונים האלה כבר מפותחת5,9,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי יחסית לזיהוי immunohistochemical של סיבי השריר-סוג5,7,8,10, יחד עם רומן חצי אוטומטיות אלגוריתם שמאיץ את ניתוח של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים עם דיוק.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, סיפקנו כיוון שימושי לצורך זיהוי סוגי סיבי שריר השלד. בעשותו כן, נתאר באלגוריתם הרומן לניתוח הנתונים.
מאז התוצאות שלנו במידה רבה לאשר את אלה של דוחות קודמים5,8,10 , משקפים משלנו מדידות ידניות, האלגוריתם מופיע לדייק. ובכל ז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו אסירי תודה קרן Boettcher, האגודה נוירודגנרטיביות (#17-II-344) על תמיכתם של מחקר זה.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
