माउस कंकाल मांसपेशियों आकृति विज्ञान और फाइबर प्रकार की रचना के अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण
Summary
Immunohistochemical मायोसिन भारी श्रृंखला isoforms के दाग कंकाल मांसपेशी फाइबर के राज्य के अत्याधुनिक भेदभाव के रूप में उभरा है-प्रकार (ie., प्रकार मैं, प्रकार आईआईए, प्रकार IIX, प्रकार IIB) । यहाँ, हम फाइबर प्रकार और फाइबर आकृति विज्ञान के तेजी से आकलन की सुविधा है कि एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म के साथ एक दाग प्रोटोकॉल उपस्थित ।
Abstract
साल के लिए, कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार के बीच भेद सबसे अच्छा मायोसिन-ATPase धुंधला द्वारा visualized थे । हाल ही में, immunohistochemical मायोसिन भारी श्रृंखला के दाग (MyHC) isoforms फाइबर के एक महीन भेदभाव के रूप में उभरा है प्रकार । प्रकार I, प्रकार आईआईए, प्रकार IIX और प्रकार IIB फाइबर अब उनके MyHC प्रोफ़ाइल के आधार पर परिशुद्धता के साथ पहचाना जा सकता है; हालांकि, इन आंकड़ों के मैनुअल विश्लेषण धीमी और नीचे सही थकाऊ जा सकता है । इस संबंध में, फाइबर प्रकार संरचना और आकृति विज्ञान के तेजी से सटीक आकलन एक बहुत ही वांछनीय उपकरण है । यहां, हम राज्य के अत्याधुनिक immunohistochemical के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म है कि फाइबर प्रकार और फाइबर आकृति विज्ञान के विश्लेषण में तेजी लाने के साथ समारोह में माउस hindlimb मांसपेशी से प्राप्त जमे हुए वर्गों में MyHCs के धुंधला । के रूप में की उंमीद है, soleus मांसपेशी प्रकार मैं और प्रकार आईआईए फाइबर के लिए दाग प्रदर्शित, लेकिन प्रकार IIX या प्रकार IIB फाइबर के लिए नहीं । दूसरी ओर, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी प्रकार IIX और प्रकार IIB फाइबर, प्रकार आईआईए फाइबर और कम या कोई प्रकार मैं फाइबर का एक छोटा सा अंश की मुख्य रूप से बना था । कई छवि रूपांतरणों फाइबर आकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं (यानी, पार अनुभागीय क्षेत्र (CSA), अधिक से अधिक और न्यूनतम Feret व्यास) को मापने के प्रयोजन के लिए संभाव्यता नक्शे उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन पैरामीटर्स के लिए प्राप्त मानों को तब मैंयुअल रूप से प्राप्त मानों से तुलना किया गया था । CSA, अधिक से अधिक या न्यूनतम Feret व्यास (सभी p & #62; ०.०५) के संबंध में विश्लेषण के किसी भी मोड के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, जो हमारी विधि की सटीकता का संकेत देता है । इस प्रकार, हमारे immunostaining विश्लेषण प्रोटोकॉल उंर बढ़ने और मायोपथी के कई मॉडलों में मांसपेशी संरचना पर प्रभाव की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
यह कुछ समय के लिए ज्ञात किया गया है कि कंकाल की मांसपेशी कई प्रकार के एक फाइबर से बना है1. शुरू में, फाइबर के दो समूहों उनके सिकुड़ा गुण और नाम, उचित रूप में, धीमी गति से चिकोटी (प्रकार मैं) और तेजी से चिकोटी (प्रकार द्वितीय) के आधार पर विशेषता थे । इन श्रेणियों के आगे फाइबर चयापचय के आधार पर प्रतिष्ठित किया गया । चूंकि प्रकार मैं फाइबर oxidative चयापचय पर mitochondria और निर्भर में अमीर हैं, वे मजबूती से सकारात्मक nicotinamide द्वारा आविर्भाव किया गया adenine dinucleotide-tetrazolium रिडक्टेस (नध-TR) diaphorase2 या succinate डिहाइड्रोजनेज (SDH)3 दाग. इसके विपरीत, प्रकार द्वितीय फाइबर नध के कम और चर डिग्री का प्रदर्शन-TR diaphorase या SDH धुंधला और दो तेजी से चिकोटी उपसमूह (प्रकार आईआईए और प्रकार IIB) में विभाजित किया गया कुछ हद तक कच्चे अपने रिश्तेदार oxidative क्षमताओं पर आधारित है । फाइबर के बीच ये भेद मायोसिन-ATPase धुंधला जहां प्रकार मैं एक पूर्व के बाद अंधेरे दाग फाइबर द्वारा और अधिक प्रभावी ढंग से कल्पना की गई है पीएच ४.० और प्रकार IIB फाइबर अवशोषित प्रकार आईआईए फाइबर के साथ पीएच १०.० पर पूर्व की गर्मी के बाद वेग सना हुआ मध्यवर्ती4.
हाल ही में, मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) isoforms के immunohistochemical धुंधला फाइबर के एक महीन भेदभाव के रूप में उभरा है-प्रकार5। प्रकार मैं, प्रकार आईआईए और प्रकार IIB फाइबर सभी परिशुद्धता के साथ उनकी MyHC प्रोफ़ाइल के आधार पर पहचान की जा सकती है । इसके अलावा, एक और तेज-चयापचय मध्यवर्ती फाइबर प्रकार, प्रकार IIX,6की पहचान की गई है चिकोटी । संकर फाइबर एक से अधिक MyHC एक्सप्रेस भी5,7,8की पुष्टि की गई है । कुछ प्रजातियों जैसे बिल्ली और लंगूर को व्यक्त नहीं करने के लिए जाना जाता है प्रकार IIB MyHCs6। हालांकि MyHC immunostaining वर्तमान में मांसपेशी संरचना के राज्य के अत्याधुनिक आकलन है, इस तकनीक के माध्यम से प्राप्त डेटा का विश्लेषण बोझिल और समय लेने वाली स्वचालित सहायता के बिना है । इस अंत करने के लिए, अर्द्ध स्वचालित तरीकों का एक मुट्ठी भर इन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए5,9,10विकसित किया गया है । यहां, हम मांसपेशी फाइबर की immunohistochemical पहचान के लिए एक अपेक्षाकृत मानक प्रोटोकॉल मौजूद-प्रकार5,7,8,10, साथ एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म कि फाइबर के विश्लेषण में तेजी लाने के प्रकार और सटीकता के साथ फाइबर आकृति विज्ञान.
Protocol
चूहों को शामिल करने वाली सभी प्रक्रियाओं कोलोराडो विश्वविद्यालय-Anschutz चिकित्सा परिसर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (91813 (05) 1 d) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. Day 1: प्राइमरी (1 & #176;) गोजातीय सीरम ए?…
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार की पहचान के लिए उपयोगी दिशा प्रदान की है । ऐसा करने में, हम डेटा के विश्लेषण के लिए एक उपंयास एल्गोरिथ्म का वर्णन ।
हमारे परिणामों के बाद से मोटे तौर पर पिछ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अनुसंधान के उनके समर्थन के लिए Boettcher फाउंडेशन और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस एसोसिएशन (#17-II-३४४) के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
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