Halvautomatisk analyse av musen Skjelettmuskel morfologi og Fiber-type sammensetning
Summary
Immunohistochemical farging av myosin tunge kjeden isoformene har dukket opp som den state-of-the-art diskriminator skjelettlidelser muskel fiber-type (dvs.type I-, skriver IIA, Skriv inn IIX, skriver IIB). Her presenterer vi en fargeprotokoll sammen med en roman halvautomatisk algoritme som muliggjør rask vurdering av fiber-type og fiber morfologi.
Abstract
I år, var det beste visualisere forskjellene mellom skjelettlidelser muskel fiber av myosin-ATPase flekker. Nylig har immunohistochemical farging av myosin tunge kjede (MyHC) isoformene framstått som en finere diskriminator fiber-type. Type I, type IIA, skriver IIX og type IIB Fibre kan nå bli identifisert med presisjon sine MyHC profiler; men manuelle analyser av disse dataene kan være langsom og ned-høyre kjedelig. I denne forbindelse, er rask, nøyaktig vurdering av fiber-type sammensetning og morfologi et svært ønskelig verktøy. Her presenterer vi en protokoll for state-of-the-art immunohistochemical farging av MyHCs i frosne snitt fra musen hindlimb muskler sammen med en roman halvautomatisk algoritme som akselererer analyse av fiber-type og fiber morfologi. Som forventet, soleus muskelen vises flekker type I og type IIA fibre, men ikke for typen IIX eller type IIB fibre. På den annen side, tibialis fremre muskelen besto hovedsakelig av typen IIX og type IIB fibre, en liten brøkdel av typen IIA fiber og lite eller ingen type jeg fibrer. Flere bilde transformasjoner ble brukt til å generere sannsynlighet kart for å måle ulike aspekter av fiber morfologi (i.e.tverrsnitt (CSA), maksimal og minimal Feret diameter). Verdiene innhentet for disse parameterne ble deretter sammenlignet med manuelt fått verdier. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom enten analyse med hensyn til CSA, maksimal eller minimal Feret diameter (alle p > 0,05), som angir nøyaktigheten av vår metode. Dermed kan våre immunostai-analyse-protokollen brukes å undersøke virkningene på muskel komposisjon i mange modeller av aldring og muskeldystrofi.
Introduction
Det har vært kjent en tid at Skjelettmuskel består av én fibre av mange typer1. I utgangspunktet to grupper av fibrene var preget basert på kontraktile egenskapene og kalt, riktig, bremse-trekning (type jeg) og raske-trekning (type II). Disse kategoriene videre ut basert på fiber metabolisme. Siden type jeg fibrer er rike på mitokondrier og avhengige oksidativt metabolisme, de var belyst av robust positiv nikotinamid adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase2 eller succinate dehydrogenase (SDH)3 flekker. Derimot type II fibrer utstilt mindre og varierende grader av NADH-TR diaphorase eller SDH flekker og ble delt inn i to raske-trekning undergrupper (Skriv inn IIA og IIB) noe primitivt basert på deres relative oksidativt kapasiteter. Disse visualisere forskjellene mellom fiber har vært mer effektivt ved myosin-ATPase flekker hvor skriver jeg fiber flekker mørk etter en pre-inkubering ved pH 4.0 og type IIB fiber absorbere bunnfall følgende pre-inkubering ved pH 10.0 med type IIA fiber farging intermediately4.
Nylig har immunohistochemical farging av myosin tunge kjede (MyHC) isoformene framstått som en finere diskriminator fiber-type5. Type I, type IIA og type IIB Fibre kan alle identifiseres med presisjon sine MyHC profiler. I tillegg en annen raske-trekning metabolically mellomliggende fiber type, type IIX, har vært identifisert6. Hybrid fiber uttrykke flere MyHC har også blitt bekreftet5,7,8. Noen arter som katten og bavian er kjent for ikke å uttrykke Type IIB MyHCs6. Om MyHC immunostaining er state-of-the-art vurdering av muskel komposisjon, er analyse av dataene innhentet via denne teknikken tungvint og tidkrevende uten automatisert hjelp. Dette er en håndfull halvautomatisk metoder for å analysere disse dataene utviklet5,9,10. Her presenterer vi en relativt standardprotokoll for immunohistochemical identifikasjon av muskel fiber-type5,7,8,10, med en roman halvautomatisk algoritme som akselererer analyse av fiber-type og fiber morfologi med nøyaktighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi gitt nyttig retning for identifikasjon av skjelettlidelser muskel fiber. Dermed beskriver vi en ny algoritme for analyse av dataene.
Siden resultatene hovedsakelig bekrefte de tidligere rapporter5,8,10 og reflekterer våre egne manuelle målinger, synes algoritmen å være nøyaktig. Likevel, møtte vi noen sjeldne eksperimentelle fallgruver inkludert uklart fiber grenser fra snitting gjens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Boettcher stiftelsen og amyotrofisk Lateral sklerose Association (#17-II-344) for deres støtte i denne forskningen.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
