Halvautomatisk analys av mus skelettmuskulaturen morfologi och Fiber-typ sammansättning
Summary
Immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain isoformer har vuxit fram som den state-of-the-art diskriminator av Skelett muskel fiber-typ (dvstyp I, typ IIA, typ IIX, typ IIB). Här presenterar vi en färgning protokollet tillsammans med en ny halvautomatisk algoritm som underlättar snabb bedömning av fiber-typ och fiber morfologi.
Abstract
I år var distinktioner mellan skelett muskelfibertyperna bäst visualiseras av myosin-ATPas färgning. Mer nyligen, immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain (MyHC) isoformer har framträtt som en finare diskriminator av fiber-typen. Typ I, typ IIA och typ IIX och typ IIB fibrer kan nu identifieras med precision utifrån deras MyHC profil; men manuell analys av dessa data kan vara långsam och ned-höger långtråkig. I detta avseende, är snabb, korrekt bedömning av fiber-typ sammansättning och morfologi en mycket önskvärd verktyg. Här presenterar vi ett protokoll för state-of-the-art immunhistokemisk färgning av MyHCs i frusna snitt erhållits från mus bakbenet muskel i konsert med en ny halvautomatisk algoritm som accelererar analys av fiber-typ och fiber morfologi. Som förväntat, soleus muskel visas färgning för typ I och typ IIA fibrer, men inte för typ IIX eller typ IIB fibrer. Däremot, tibialis anterior muskeln bestod huvudsakligen av typ IIX och typ IIB fibrer, en bråkdel av typ IIA fibrer och liten eller ingen typ I fibrer. Flera bild transformationer användes för att generera sannolikhet kartor för att mäta olika aspekter av fiber morfologi (dvstvärsnittsarea (CSA), maximal och minimal Feret diameter). De värden som erhålls för dessa parametrar jämfördes sedan med manuellt-erhållande värden. Inga signifikanta skillnader observerades mellan antingen läge för analys med avseende på CSA, maximal eller minimal Feret diameter (alla p > 0,05), som anger riktigheten av vår metod. Våra immunfärgning analys protokoll kan således tillämpas på utredningen av effekter på muskel sammansättning i många modeller av åldrande och myopati.
Introduction
Det har varit känt en tid att skelettmuskulaturen består av enstaka fibrer av många typer1. Inledningsvis, två grupper av fibrer karakteriserades baserat på deras kontraktila egenskaper och benämn, på lämpligt sätt, långsamt rycka (typ I) och fast-ryckning (typ II). Dessa kategorier var ytterligare distingerade på grundval av fiber metabolism. Sedan typ I fibrer är rika i mitokondrier och beroende av oxidativ metabolism, de var klarlagd av kraftfullt positiva nikotinamid-adenin-dinukleotid-tetrazolium reduktas (NADH-TR) diaphorase2 eller succinat dehydrogenas (SDH)3 färgning. Däremot typ II fibrer uppvisade mindre och varierande grader av NADH-TR diaphorase eller SDH färgning och delades in i två snabbt rycka undergrupper (typ IIA och typ IIB) något grovt baserat på deras relativa oxidativ kapacitet. Dessa distinktioner mellan fibrerna har varit visualiseras mer effektivt av myosin-ATPas färgning där typ I fibrer fläcken mörka efter en före inkubering vid pH 4.0 och typ IIB fibrer absorberar fällning följande före inkubering vid pH 10,0 med typ IIA fibrer färgning intermediärt4.
Mer nyligen, immunhistokemisk färgning för myosin heavy chain (MyHC) isoformer har framträtt som en finare diskriminator fiber-typ5. Typ I, typ IIA och typ IIB fibrer kan alla identifieras med precision utifrån deras MyHC profil. Dessutom en annan snabbt rycka metaboliskt-intermediate fiber typ, typ IIX, har varit identifierad6. Hybrid fibrer att uttrycka mer än en MyHC har också bekräftat5,7,8. Vissa arter såsom katten och babian är känt att inte express typ IIB MyHCs6. Även MyHC immunfärgning är för närvarande den state-of-the-art bedömningen av muskel sammansättning, är analysen av data som erhållits via denna teknik besvärlig och tidskrävande utan automatisk hjälp. I detta syfte har en handfull semi automatiserade metoder att analysera dessa data varit utvecklade5,9,10. Här presenterar vi ett relativt standardprotokoll för immunhistokemiska identifiering av muskelfiber-typ5,7,8,10, tillsammans med en halvautomatisk roman algoritmen som accelererar analys av fiber-typ och fiber morfologi med noggrannhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi tillhandahållit användbar riktning för identifiering av skelett muskelfibertyperna. Så beskriver vi en ny algoritm för analys av data.
Eftersom våra resultat i hög grad bekräfta de i tidigare rapporter5,8,10 och speglar våra egna manuella mätningar, verkar algoritmen vara korrekt. Fortfarande, vi stött på några ovanliga experimentella fallgropar inklusive oklart fiber gränser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att stiftelsen Boettcher och amyotrofisk lateralskleros Association (nr 17-II-344) för deras stöd för denna forskning.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
